一、配膠

注意一定要將玻璃板洗凈，zui后用ddH2O沖洗，將與膠接觸的一面鄉(xiāng)下傾斜置于干凈的紙巾晾干。

分離膠及濃縮膠均可事先配好(除AP及TEMED外)，過濾后作為儲(chǔ)存液避光存放于4度，可至少存放1個(gè)月，臨用前取出室溫平衡(否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會(huì)使低溫時(shí)溶解于儲(chǔ)存液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘)，加入10%AP(0.7~0.8：100,分離 膠濃度越高AP濃度越低，15%的分離膠可用到0.5：100)及TEMED(分離膠用0.4：1000，15%的可用到0.3：1000，濃縮膠用0.8：1000)即可，如室溫較低可升高10%AP及TEMED濃度到《分子克隆》建議濃度。

封膠：灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，膠濃度<10%時(shí)可用0.1%的SDS封，濃度>10%時(shí)用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。封膠后切記，勿動(dòng)。

待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddH2O沖洗干凈，然后加少量0.1%的SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。片刻后倒掉SDS，將玻璃板倒立放置片刻控凈。

4.灌好濃縮膠后1h拔除梳子，注意在拔除梳子時(shí)宜邊加水邊拔，以免有氣泡進(jìn)入梳孔使梳孔變形。撥出梳子后用ddH2O沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨后用0.1%的SDS封膠。若上樣孔有變形，可用適當(dāng)粗細(xì)的針頭撥正;若變形嚴(yán)重，可在去除殘膠后用較薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上樣，長(zhǎng)時(shí)間有利于膠結(jié)構(gòu)的形成，因?yàn)槿庋塾^的膠凝時(shí)其內(nèi)部分子的排列尚未完成。

(10%的AP現(xiàn)配現(xiàn)用，如在4℃存放勿超過兩周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，棄掉.)

二.樣品處理

1.培養(yǎng)的細(xì)胞(定性)：

⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍(冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落)。

⑵ 對(duì)于6孔板來說每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。

⑶ 100℃，1min。

⑷ 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后在EP管中煮沸10min，期間vortex 2~3次。

⑸ 用干凈的針尖挑絲，如有團(tuán)塊則將團(tuán)塊棄掉，如果沒有團(tuán)塊但有拉絲現(xiàn)象，則可以將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無團(tuán)塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反復(fù)抽吸來降低溶液粘滯度，便于上樣。

⑹ 待樣品恢復(fù)到室溫后上樣。

2.培養(yǎng)的細(xì)胞(定量)：

⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍(冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落)。

⑵ 加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上10~20min。

⑶ 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集在EP管后超聲(100~200w)3s，2次。

⑷ 12000g離心，4℃，2min。

⑸ 取少量上清進(jìn)行定量。

⑹ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣，剩余溶液(溶于1×loading buffer)可以低溫儲(chǔ)存，-70℃一個(gè)月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。

3.組織：

⑴ 勻漿 對(duì)于心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手動(dòng)或電動(dòng)勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。

⑵ 12000g離心，4℃，2min。

⑶ 取少量上清進(jìn)行定量。

⑷ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣，剩余溶液(溶于1×loading buffer)可以低溫儲(chǔ)存，-70℃一個(gè)月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。

(裂解液配方：Tris-Cl (pH7.4) 20mM，EDTA 1mM

由于蛋白酶抑制劑可影響蛋白定量，且新鮮蛋白很少降解，故可不加，如加按建議比例即可。提取磷酸化的蛋白還需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM)。

1×loading buffer配方：10% 甘油，50mM Tris·Cl (pH6.8)，2% β-巰基乙醇，0.2~0.5‰溴酚藍(lán)，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS終濃度勿超過10%。

對(duì)于心臟，肌肉等碎屑較多的組織可用5%的SDS，肝腎等組織2%即可。)

三.電泳

1.上樣前將膠板下的氣泡趕走。

2.所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的1×loading buffer上樣，Marker也用1×loading buffer調(diào)整至與樣品等體積。

2.以初始電壓為45V時(shí)的電流強(qiáng)度進(jìn)行穩(wěn)流電泳，當(dāng)電壓達(dá)65V時(shí)改為穩(wěn)壓電泳。

3.在目的蛋白泳動(dòng)至距膠下緣1cm以上結(jié)束。

電泳液配方：Tris-base 3g, glycine 14.4g, 0.1% SDS(10ml 10% SDS)/L

Tris-base 1.5g, glycine 7.2g, 0.1% SDS(5ml 10% SDS)/0.5L

四.轉(zhuǎn)膜

1.電泳結(jié)束前20分鐘左右戴上手套開始準(zhǔn)備：

濕轉(zhuǎn)使用常規(guī)電轉(zhuǎn)液：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去離子水至1,000ml。干轉(zhuǎn)則取此轉(zhuǎn)移液，每50ml加入10%SDS180ul。

浸泡NC膜：將NC膜平鋪于去離子水面，靠毛細(xì)作用自然吸水后再*浸入水中10min以排除氣泡，隨后浸泡入轉(zhuǎn)移液中。PVDF膜則在M-OH中浸泡20min以上后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中。將濾紙也浸入轉(zhuǎn)移液中。

2.取膠：

將膠卸下，保留30-100KD或分子量范圍更廣些的膠(以便以后雜其他感興趣的蛋白)，左上切角，在轉(zhuǎn)移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側(cè)一張(干轉(zhuǎn)每側(cè)三張)濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分(尤其是干轉(zhuǎn)，以防止短路)

3.轉(zhuǎn)膜：

濕轉(zhuǎn)：電轉(zhuǎn)槽用去離子水淋洗晾干，加入1,000ml電轉(zhuǎn)液。將膠平鋪于海綿上，滴加少許電轉(zhuǎn)液再次驅(qū)趕氣泡，封緊后放入電轉(zhuǎn)槽，注意膜在正極一側(cè)。降溫，將電泳槽置于冰水混合物中。恒流100mA過夜，或400mA，4h。注意不同蛋白的要求不同。

干轉(zhuǎn)：用電轉(zhuǎn)液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉(zhuǎn)液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)。負(fù)載電壓不宜超過1V/cm2膠面積。

電轉(zhuǎn)液配方： Tris-base 3g, glycine 14.4g, 200ml 甲醇/1L

五.封閉及雜交

1.封閉：

將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時(shí)。必要時(shí)可先用麗春紅染色(2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液)觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。

2.結(jié)合一抗：

一抗的準(zhǔn)備：使用反貼法時(shí)每張3×9cm2膜約需2ml一抗稀釋液。

反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時(shí)或4℃靜置過夜。在反應(yīng)體系外面罩一濕潤(rùn)平皿以防止液體過多蒸發(fā)。

3.洗滌：

一抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

4.結(jié)合二抗：

根據(jù)一抗來源選擇合適的二抗，根據(jù)鑒定方法選擇HRP或AP標(biāo)記的抗體，按相應(yīng)比例稀釋(1:1000~1:10000)，室溫輕搖一小時(shí)。

5.洗滌：

二抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

PBST： 1×PBS TTBS： Tris-HCl 20mM, pH 7.4 (25℃)

Tween-20 0.01% ~0.02% NaCl 150mM

Tween-20 0.05%

封閉液與抗體溶劑均為含5%脫脂奶粉的PBST或TTBS，臨用時(shí)取200ml PBST或 TTBS加入10g脫脂奶粉即為封閉液。

六.發(fā)光鑒定

一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。

1.HRP-ECL發(fā)光法：

將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶(5min左右)后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即*浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片*定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker，進(jìn)行分析與掃描。

2.AP-NBT/BICP顯色法：

每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個(gè) EP管中，每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體(如報(bào)紙)遮擋光線，顯色20s后每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時(shí)將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。

背景深淺與一抗的質(zhì)量及二抗的量有關(guān)，當(dāng)然如果暴光時(shí)間長(zhǎng)達(dá)半小時(shí)，出現(xiàn)背景是正常的。

七.增強(qiáng)敏感性

若目的條帶未出現(xiàn)，或很淡，可試用以下方法增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度：

用清水漂洗膜數(shù)分鐘，重加發(fā)光液進(jìn)行曝光，可延長(zhǎng)曝光時(shí)間。

將膜在PBST或TTBS中洗滌30min或更長(zhǎng)，期間至少換2次液。

封閉40~60min

一抗雜交，室溫1h。37℃ 1h 會(huì)更強(qiáng)，但可能增加非特異條帶。

PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。

二抗雜交，37℃ 1h。

PBST或TTBS洗膜20min，期間換2次液。

發(fā)光鑒定。

若條帶仍未出現(xiàn)或很淡，可以再用PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。

10.三抗雜交，室溫1h。37℃ 1h 會(huì)更強(qiáng)，但可能增加非特異條帶。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此時(shí)三抗可以選擇兔抗羊或鼠抗羊等。

11.PBST或TTBS洗滌膜20min，期間換2次液。

12.發(fā)光鑒定。

一抗溶液中加入0.2% 疊氮鈉后可4℃存放至少2周(一個(gè)月我也用過，沒問題，再長(zhǎng)時(shí)間還沒試)

八.NC膜的多次使用

一張NC膜可使用多次，對(duì)多種蛋白進(jìn)行雜交，步驟與“七.增強(qiáng)敏感性”相近。

如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預(yù)計(jì)位置差別則只需用PBST洗滌掉發(fā)光液(10min×3次)后從一抗雜交開始，后續(xù)步驟同前。

如前次雜交結(jié)果條帶距離本次雜交的蛋白的預(yù)計(jì)位置較近則需更強(qiáng)的洗滌，可用 strip液(可用雜交袋)于室溫?fù)u動(dòng)洗滌30min~60min，然后用PBST洗滌10min×3次，再?gòu)姆忾]開始，后續(xù)步驟同前。

對(duì)于雜交若干次的膜，如果常規(guī)洗滌方法不易去掉眾多條帶，可用強(qiáng)度更強(qiáng)的自配的strip液(可用雜交袋)于50℃洗滌30min，然后用PBST洗滌10min×3次，再?gòu)姆忾]開始，后續(xù)步驟同前。