掌握蛋白鑒定方法

傳統(tǒng)的蛋白鑒定方法，如免疫印跡法、內(nèi)肽的化學(xué)測(cè)序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一個(gè)有機(jī)體中有意義的基因的過表達(dá)通常耗時(shí)、耗力，不適合高流通量的篩選。 目前，所選用的技術(shù)包括對(duì)于蛋白鑒定的圖象分析、微量測(cè)序、進(jìn)一步對(duì)肽片段進(jìn)行鑒定的氨基酸組分分析和與質(zhì)譜相關(guān)的技術(shù)。

1 氨基酸組分分析

1977年*作為鑒定蛋白質(zhì)的一種工具，是一種*的“腳印”技術(shù)。 利用蛋白質(zhì)異質(zhì)性的氨基酸組分特征，成為一種獨(dú)立于序列的屬性，不同于肽質(zhì)量或序列標(biāo)簽。 Latter*表明氨基酸組分的數(shù)據(jù)能用于從2-DE凝膠上鑒定蛋白質(zhì)。 通過放射標(biāo)記的氨基酸來測(cè)定蛋白質(zhì)的組分，或者將蛋白質(zhì)印跡到PVDF膜上，在155℃進(jìn)行酸性水解1 h，通過這一簡(jiǎn)單步驟的氨基酸的提取，每一樣品的氨基酸在40min內(nèi)自動(dòng)衍生并由色譜分離，常規(guī)分析為100個(gè)蛋白質(zhì)/周。 依據(jù)代表兩組分間數(shù)目差異的分?jǐn)?shù)，對(duì)數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)進(jìn)行排榜，“冠-軍”蛋白質(zhì)具有與未知蛋白質(zhì)zui相近的組分，考慮冠亞軍蛋白質(zhì)分?jǐn)?shù)之間的差異，僅處于冠-軍的蛋白質(zhì)的可信度大。 Internet上存在多個(gè)程序可用于氨基酸組分分析，如AACompIdent，ASA，F(xiàn)INDER，AAC-PI，PROP-SEARCH等，其中，在PROP-SEARCH中，組分、序列和氨基酸的位置被用來檢索同源蛋白質(zhì)。 但仍存在一些缺點(diǎn)，如由于不足的酸性水解或者部分降解會(huì)產(chǎn)生氨基酸的變異。 故應(yīng)聯(lián)合其他的蛋白質(zhì)屬性進(jìn)行鑒定。 
2  微量測(cè)序（microsequencing）

蛋白質(zhì)的微量測(cè)序已成為蛋白質(zhì)分析和鑒定的基石，可以提供足夠的信息。 盡管氨基酸組分分析和肽質(zhì)指紋譜（PMF）可鑒定由2-DE分離的蛋白，但zui普通的N-末端Edman降解仍然是進(jìn)行鑒定的主要技術(shù)。 目前已實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)微量測(cè)序的自動(dòng)化。 首先使經(jīng)凝膠分離的蛋白質(zhì)直接印跡在PVDF膜或玻璃纖維膜上，染色、切割，然后直接置于測(cè)序儀中，可用于subpicomole水平的蛋白質(zhì)的鑒定。 但有幾點(diǎn)需注意：Edman降解很緩慢，序列以每40 min 1個(gè)氨基酸的速率產(chǎn)生；與質(zhì)譜相比，Edman降解消耗大；試劑昂貴，每個(gè)氨基酸花費(fèi)3～4$。 這都說明泛化的Edman降解蛋白質(zhì)不適合分析成百上千的蛋白質(zhì)。 然而，如果在一個(gè)凝膠上僅有幾個(gè)有意義的蛋白質(zhì)，或者如果其他技術(shù)無法測(cè)定而克隆其基因是必需的，則需要進(jìn)行泛化的Edman降解測(cè)序。

近來，應(yīng)用自動(dòng)化的Edman降解可產(chǎn)生短的N-末端序列標(biāo)簽，這是將質(zhì)譜的序列標(biāo)簽概念用于Edman降解，業(yè)已成為一種強(qiáng)有力的蛋白質(zhì)鑒定。 當(dāng)對(duì)Edman的硬件進(jìn)行簡(jiǎn)單改進(jìn)，以迅速產(chǎn)生N-末端序列標(biāo)簽達(dá)10～20個(gè)/d，序列檢簽將適于在較小的蛋白質(zhì)組中進(jìn)行鑒定。若聯(lián)合其他的蛋白質(zhì)屬性，如氨基酸組分分析、肽質(zhì)質(zhì)量、表現(xiàn)蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)，可以更加可信地鑒定蛋白質(zhì)。 選擇BLAST程序，可與數(shù)據(jù)庫相配比。 目前，采用一種Tagldent的檢索程序，還可以進(jìn)行種間比較鑒定，又提高了其在蛋白質(zhì)組研究中的作用。

3  與質(zhì)譜（mass spectrometry）相關(guān)的技術(shù)

質(zhì)譜已成為連接蛋白質(zhì)與基因的重要技術(shù)，開啟了大規(guī)模自動(dòng)化的蛋白質(zhì)鑒定之門。 用來分析蛋白質(zhì)或多肽的質(zhì)譜有兩個(gè)主要的部分，1）樣品入機(jī)的離子源，2）測(cè)量被介入離子的分子量的裝置。 首先是基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF）為一脈沖式的離子化技術(shù)。 它從固相標(biāo)本中產(chǎn)生離子，并在飛行管中測(cè)其分子量。 其次是電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS），是一連續(xù)離子化的方法，從液相中產(chǎn)生離子，聯(lián)合四極質(zhì)譜或在飛行時(shí)間檢測(cè)器中測(cè)其分子量。 近年來，質(zhì)譜的裝置和技術(shù)有了長足的進(jìn)展。

在MALDI-TOF中，zui重要的進(jìn)步是離子反射器（ion reflectron）和延遲提?。╠elayed ion extraction），可達(dá)相當(dāng)精確的分子量。 在ESI-MS中，納米級(jí)電霧源（nano-electrospray source）的出現(xiàn)使得微升級(jí)的樣品在30～40 min內(nèi)分析成為可能。

將反相液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜（tandem MS）聯(lián)用，可在數(shù)十個(gè)picomole的水平檢測(cè)；若利用毛細(xì)管色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，則可在低picomole到高femtomole水平檢測(cè)；當(dāng)利用毛細(xì)管電泳與串聯(lián)質(zhì)譜連用時(shí)，可在小于femtomole的水平檢測(cè)。 甚至可在attomole水平進(jìn)行。 目前多為酶解、液相色譜分離、串聯(lián)質(zhì)譜及計(jì)算機(jī)算法的聯(lián)合應(yīng)用鑒定蛋白質(zhì)。 下面以肽質(zhì)指紋術(shù)和肽片段的測(cè)序來說明怎樣通過質(zhì)譜來鑒定蛋白質(zhì)。

(1)肽質(zhì)指紋術(shù)（peptide mass fingerprint， PMF）

由Henzel等人于1993年提出。 用酶（zui常用的是胰酶）對(duì)由2-DE分離的蛋白在膠上或在膜上于精氨酸或賴氨酸的C-末端處進(jìn)行斷裂，斷裂所產(chǎn)生的精確的分子量通過質(zhì)譜來測(cè)量（MALDI-TOF-MS，或?yàn)镋SI-MS），這一技術(shù)能夠完成的肽質(zhì)量可精確到0。1個(gè)分子量單位。 所有的肽質(zhì)量zui后與數(shù)據(jù)庫中理論肽質(zhì)量相配比（理論肽是由實(shí)驗(yàn)所用的酶來“斷裂”蛋白所產(chǎn)生的）。 配比的結(jié)果是按照數(shù)據(jù)庫中肽片段與未知蛋白共有的肽片段數(shù)目作一排行榜，“冠-軍”肽片段可能代表一個(gè)未知蛋白。若冠亞軍之間的肽片段存在差異，且這個(gè)蛋白可與實(shí)驗(yàn)所示的肽片段覆蓋良好，則說明正確鑒定的可能性。

(2)肽片段（peptide fragment）的部分測(cè)序

肽質(zhì)指紋術(shù)對(duì)其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白質(zhì)。 為進(jìn)一步鑒定蛋白質(zhì)，出現(xiàn)了一系列的質(zhì)譜方法用來描述肽片段。 用酶或化學(xué)方法從N-或C-末端按順序除去氨基酸，形成梯形肽片段（ladder peptide）。 首先以一種可控制的化學(xué)模式從N-末端降解，可產(chǎn)生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定數(shù)目的肽質(zhì)量由MALDI-TOF-MS測(cè)量。 另一種方法涉及羧基肽酶的應(yīng)用，從C-末端除去不同數(shù)目的氨基酸形成肽片段。 化學(xué)法和酶法可產(chǎn)生相對(duì)較長的序列，其分子量精確至以區(qū)別賴氨酸（128。09）和谷氨酰胺（128。06）。 或者，在質(zhì)譜儀內(nèi)應(yīng)用源后衰變（post-source decay， PSD）和碰撞誘導(dǎo)解離（collision-induced dissociation， CID），目的是產(chǎn)生包含有僅異于一個(gè)氨基酸殘基質(zhì)量的一系列肽峰的質(zhì)譜。 因此，允許推斷肽片段序列。 肽片段PSD的分析在MALDI反應(yīng)器上能產(chǎn)生部分序列信息。 首行肽質(zhì)指紋鑒定。 之后，一個(gè)有意義的肽片段在質(zhì)譜儀被選作“母離子”，在飛行至離子反應(yīng)器的過程中降解為“子離子”。 在反應(yīng)器中，用逐漸降低的電壓可測(cè)量至檢測(cè)器的不同大小的片段。 但經(jīng)常產(chǎn)生不*的片段。 現(xiàn)在用肽片段來測(cè)序的方法始于70年代末的CID，可以一個(gè)三聯(lián)四極質(zhì)譜ESI-MS或MALDI-TOF-MS聯(lián)合碰撞器內(nèi)來完成。 在ESI-MS中，由電霧源產(chǎn)生的肽離子在質(zhì)譜儀的第-一個(gè)四極質(zhì)譜中測(cè)量，有意義的肽片段被送至第二個(gè)四極質(zhì)譜中，惰性氣體轟擊使其成為碎片，所得產(chǎn)物在第三個(gè)四極質(zhì)譜中測(cè)量。 與MALDI-PSD相比，CID穩(wěn)定、強(qiáng)健、普遍，肽離子片段基本沿著酰胺鍵的主架被轟擊產(chǎn)生梯形序列。 連續(xù)的片段間差異決定此序列在那一點(diǎn)的氨基酸的質(zhì)量。 由此，序列可被推測(cè)。 由CID圖譜還可獲得的幾個(gè)序列的殘基，叫做“肽序列標(biāo)簽”。 這樣，聯(lián)合肽片段母離子的分子量和肽片段距N- C端的距離將足以鑒定一個(gè)蛋白質(zhì)。

4  圖象分析技術(shù)（Image analysis）

“滿天星”式的2-DE圖譜分析不能依靠本能的直覺，每一個(gè)圖象上斑點(diǎn)的上調(diào)、下調(diào)及出現(xiàn)、消失，都可能在生理和病理狀態(tài)下產(chǎn)生，必須依靠計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)處理，進(jìn)行定量分析。 在一系列高質(zhì)量的2-DE凝膠產(chǎn)生（低背景染色，高度的重復(fù)性）的前提下，圖象分析包括斑點(diǎn)檢測(cè)、背景消減、斑點(diǎn)配比和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建。 首先，采集圖象通常所用的系統(tǒng)是電荷耦合CCD（charge coupled device）照相機(jī)；激光密度儀（laser densitometers）和Phospho或Fluoroimagers，對(duì)圖象進(jìn)行數(shù)字化。 并成為以象素（pixels）為基礎(chǔ)的空間和網(wǎng)格。 其次，在圖象灰度水平上過濾和變形，進(jìn)行圖象加工，以進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè)。 利用Laplacian，Gaussian，DOG（difference of Gaussians） opreator使有意義的區(qū)域與背景分離，精確限定斑點(diǎn)的強(qiáng)度、面積、周長和方向。

圖象分析檢測(cè)的斑點(diǎn)須與肉眼觀測(cè)的斑點(diǎn)一致。 在這一原則下，多數(shù)系統(tǒng)以控制斑點(diǎn)的重心或zui高峰來分析，邊緣檢測(cè)的軟件可精確描述斑點(diǎn)外觀，并進(jìn)行邊緣檢測(cè)和鄰近分析，以增加精確度。 通過閾值分析、邊緣檢測(cè)、銷蝕和擴(kuò)大斑點(diǎn)檢測(cè)的基本工具還可恢復(fù)共遷移的斑點(diǎn)邊界。 以PC機(jī)為基礎(chǔ)的軟件Phoretix-2D正挑戰(zhàn)古老的Unix為基礎(chǔ)的2-D分析軟件包。 第三，一旦2-DE圖象上的斑點(diǎn)被檢測(cè)，許多圖象需要分析比較、增加、消減或均值化。 由于在2-DE中出現(xiàn)100-%的重復(fù)性是很困難的，由此凝膠間的蛋白質(zhì)的配比對(duì)于圖象分析系統(tǒng)是一個(gè)挑戰(zhàn)。 IPG技術(shù)的出現(xiàn)已使斑點(diǎn)配比變得容易。 因此，程度的相似性可通過斑點(diǎn)配比向量算法在長度和平行度觀測(cè)。 用來配比的著-名軟件系統(tǒng)包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，計(jì)算機(jī)方法如相似性、聚類分析、等級(jí)分類和主要因素分析已被采用，而神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、子波變換和實(shí)用分析在未來可被采用。 配比通常由一個(gè)人操作，其手工設(shè)定大約50個(gè)突出的斑點(diǎn)作為“路標(biāo)”，進(jìn)行交叉配比。 之后，擴(kuò)展至整個(gè)膠。

例如：精確的PI和MW（分子量）的估計(jì)通過參考圖上20個(gè)或更多的已知蛋白所組成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算未知蛋白的PI和MW。 在凝膠圖象分析系統(tǒng)依據(jù)已知蛋白質(zhì)的pI值產(chǎn)生PI網(wǎng)絡(luò)，使得凝膠上其它蛋白的PI按此分配。 所估計(jì)的精確度大大依賴于所建網(wǎng)格的結(jié)構(gòu)及標(biāo)本的類型。 已知的未被修飾的大蛋白應(yīng)該作為標(biāo)志，變性的修飾的蛋白的PI估計(jì)約在±0。25個(gè)單位。 同理，已知蛋白的理論分子量可以從數(shù)據(jù)庫中計(jì)算，利用產(chǎn)生的表觀分子量的網(wǎng)格來估計(jì)蛋白的分子量。 未被修飾的小蛋白的錯(cuò)誤率大約30%，而翻譯后蛋白的出入更大。 故需聯(lián)合其他的技術(shù)完成鑒定。