無菌操作實驗注意事項

一、 樣品采集及處理要求

1、所采集的檢驗樣品一定要具有代表性，采樣時應(yīng)首先對該批食品原料、加工、運輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等進行詳細調(diào)查，檢查是否有污染源存在。

2、根據(jù)食品的種類及數(shù)量，采樣數(shù)量及方法應(yīng)按標準檢驗方法的要求進行。

3、采樣應(yīng)注意無菌操作，容器必須滅菌，避免環(huán)境中微生物污染，容器不得使用煤 酚皂溶液，用新潔爾滅、酒精等消毒-藥物滅菌，更不能含有此類消毒-藥物或抗生素類藥物，以避免殺死樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可應(yīng)用。

4、樣品采集后應(yīng)立即送往檢驗室進行檢驗，送檢過程中一般不超過3h，如路程較遠，可保存在1～5℃環(huán)境中，如需冷凍者，則在凍存狀態(tài)下送檢。

5、檢驗室收到樣品后，進行登記（樣品名稱、送檢單位、數(shù)量、日期、編號等），觀察樣品的外觀，如果發(fā)現(xiàn)有下列情況之一者，可拒絕檢驗。
（1）樣品經(jīng)過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者，失去代表原食品檢驗意義者。
（2）瓶、袋裝食品已啟開者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品形狀者（食物中毒樣品除外）。
（3）按規(guī)定采樣數(shù)量不足者。
對送檢符合要求的樣品， 檢驗室收到后，應(yīng)立即進行檢驗，如果條件不具備，應(yīng)置4℃冰箱存放，及時準備創(chuàng)造條件，然后進行檢驗。

6、樣品檢驗時，根據(jù)其不同性狀，進行適當處理。
（1）液體樣品接種時，應(yīng)充分混合均勻，按量吸取進行接種。
（2）固體樣品，用滅菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml 滅菌生理鹽水或其他溶液中，用均質(zhì)器攪碎混勻后，按量吸取接種。
（3）瓶、袋裝食品應(yīng)用滅菌操作啟開，根據(jù)性狀選擇上述方法處理后接種。

二、無菌間使用要求

1、無菌間通向外面的窗戶應(yīng)為雙層玻璃，并要密封，不得隨意打開，并設(shè)有與無菌間大小相應(yīng)的緩沖間及推拉門，另設(shè)有0.5-0.7平方米的小窗，以備進入無菌間后傳遞物品。

2、無菌間內(nèi)應(yīng)保持清潔，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作臺面，不得存放與實驗無關(guān)的物品。
      
3、無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊， 打開紫外燈，如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時間不少于30min，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。 
    
4、處理和接種食品標本時，進入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。      

5、在無菌間內(nèi)如需要安裝空調(diào)時，則應(yīng)有過濾裝置。

三、消毒滅菌要求

微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養(yǎng)基、被污染和接種的培養(yǎng)物等，必須經(jīng)滅菌后方能使用。

（一）干熱和濕熱高壓蒸氣鍋滅菌方法

1、滅菌前準備
（1）所有需要滅菌的物品首先應(yīng)清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴密，如 用金屬筒應(yīng)將上面通氣孔打開。
（2）裝培養(yǎng)基的三角瓶塞，用紙包好，試管蓋好蓋，注射器須將管芯抽出，用紗布包 好。

2、裝放
（1）干熱滅菌器：裝放物品不可過擠，且不能接觸箱的四壁。
（2）大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品分別包扎好，直接放入消毒筒內(nèi)，物品之間不能過擠。

3、設(shè)備檢查
（1）檢查門的開關(guān)是否靈活，橡皮圈有無損壞，是否平整。
（2）檢查壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位，關(guān)好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應(yīng)按下列步驟進行：
①手提式高壓鍋在主體內(nèi)加入3L清水，立式高壓鍋加水16L（重復(fù)使用時應(yīng)將水 量補足，水變混濁需更換）；
②手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內(nèi)壁的方管中（無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用）；
③蓋好頂蓋擰緊，勿使漏氣；置滅菌器于火源上加熱，立式壓力鍋通上電源，并打開頂蓋上的排氣閥放了冷氣（水沸騰后排氣10-15min）；
④關(guān)閉排氣閥，使蒸氣壓上升到規(guī)定要求，并維持規(guī)定時間（按滅菌物品性質(zhì)與有關(guān)情況而定）；
⑤達到規(guī)定時間后，對需干燥的物品，立即打開排氣閥排出蒸氣，待壓力恢復(fù)到零時，自然冷卻至 60℃后開蓋取物，如為液體物品，不要打開排氣閥，而應(yīng)立即將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復(fù)至零，溫度降到60℃以下再開蓋取物，以防突然減壓液體劇烈沸騰或容器爆破。   
（3）臥式壓力鍋蒸氣滅菌器的使用按下列步驟進行：
①關(guān)緊鍋門，打開進氣閥，將蒸氣引入夾層進行預(yù)熱，夾層內(nèi)冷空氣經(jīng)阻氣器自動排出；
② 夾層達到預(yù)定溫度后，打開鍋室進氣閥，將蒸氣引入鍋室，鍋室內(nèi)冷空氣經(jīng)鍋室阻氣器自動排出；
③待鍋室達到規(guī)定的壓力與溫度時，調(diào)節(jié)進氣閥，使保持恒定至滅菌完成；
④自然或人工降溫至60℃再開門取物，不得使用快速排出蒸氣法，以防突然降壓，液體劇烈沸騰或容器爆破；
⑤使用自動程序控制式壓力蒸氣滅菌器，在放好物品關(guān)緊門后，應(yīng)根據(jù)物品類別按 動相應(yīng)開關(guān)，以便按要求程序自動進行滅菌，滅菌時必須利用附設(shè)儀表記錄溫度與時間以備查，操作要求應(yīng)嚴格按照廠家說明書進行。

4、滅菌溫度與時間
（1）干熱滅菌器滅菌溫度160℃，1.5-2h。
（2）壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時間一般為121℃,15min。

（二）間歇滅菌方法
1、滅菌方法系利用不加壓力的蒸氣滅菌，某些物質(zhì)經(jīng)高壓蒸氣滅菌容易破壞，可用此法滅菌。
（1）將欲滅菌物品置于鍋內(nèi)，蓋上頂蓋，打開排水口，使器內(nèi)余水排盡；
（2）關(guān)閉排水口，打開進氣門，根據(jù)需要消毒10～20min；    
（3）滅菌完畢關(guān)閉進氣門，取出物品待冷至室溫溫度，放入37℃溫箱過夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可達到滅菌目的。

2、血清凝固器使用方法，培養(yǎng)基中含有血清或雞蛋特殊成份時，因高熱會破壞其營 養(yǎng)成份，故用低溫，可使血清凝固，又可達到滅菌目的。
（1）在使用該法滅菌的血清等分裝時，需嚴格遵守無菌操作，試管、平皿也經(jīng)滅菌后使用；
（2）將培養(yǎng)基按要求使成斜面或高層，加足水后，接上電源，升溫75～90℃1h滅菌，放37℃溫箱過夜，再如此滅菌三次。

3、煮沸消毒：可用煮鍋或煮沸消毒器，水沸騰后再煮5～15 min，也可在水中加入2%石炭酸煮沸5 min，加入0.02%甲醛，80℃煮60 min均可達到滅菌目的， 但選用 煮沸消毒的增消劑時， 應(yīng)注意對物品的腐蝕性。

4、滅菌處理：滅菌后物品，按正常情況已屬無菌，從滅菌器中取出應(yīng)仔細檢查放置，以免再度污染。    
（1）物品取出，隨即檢查包裝的完整性，若有破壞或棉塞脫掉，不可作為無菌物品使用；   
（2）取出的物品，如為包裝有明顯的水浸者，不可作為無菌物品使用；
（3）培養(yǎng)基或試劑等，應(yīng)檢查是否符合達到滅菌后的色澤或狀態(tài)，未達到者應(yīng)廢棄；
（4）啟閉式容器，在取出時應(yīng)將篩孔關(guān)閉；
（5）取出的物品掉落在地或誤放不潔這處，或沾有水液，均視為受到污染，不可作為無菌物品使用；
（6）取出的合格滅菌物品，應(yīng)存放于貯藏室或防塵柜內(nèi)，嚴禁與未滅菌物品混放；
（7）凡屬合格物品，應(yīng)標有滅菌日期及有效期限；
（8）每批滅菌處理完成后，記錄滅菌品名、數(shù)量、溫度、時間、操作者。


四、有毒有菌污物處理要求

微生物實驗所用實驗器材、培養(yǎng)物等未經(jīng)消毒處理，一律不得帶出實驗室。
1、經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應(yīng)放在嚴密的容器或鐵絲筐內(nèi)，并集中存放在地點，待統(tǒng)一進行高壓滅菌。

2、經(jīng)微生物污染的培養(yǎng)物，必須經(jīng)121℃ 30min高壓滅菌。

3、染菌后的吸管，使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中，zui少浸泡24h（消毒液體不得低于浸泡的高度）再經(jīng)121℃ 30 min高壓滅菌。

4、涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，烈性菌的沖洗液必須沖在燒杯 中，經(jīng)高壓滅菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗滌。做凝集試驗用的玻片或平皿，必須高壓滅菌后洗滌。

5、打碎的培養(yǎng)物，立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭干凈。

污染的工作服或進行烈性試驗所穿的工作服、帽、口-罩等，應(yīng)放入消毒袋內(nèi)，經(jīng)高壓滅菌后方能洗滌。
   

五、培養(yǎng)基制備要求

培養(yǎng)基制備的質(zhì)量將直接影響微生物生長。因為各種微生物對其營養(yǎng)要求不*相同，培養(yǎng)目的的不同，各種培養(yǎng)基制備要求如下：
1、根據(jù)培養(yǎng)基配方的成分按量稱取，然后溶于蒸餾水中，在使用前對應(yīng)用的試劑藥 品應(yīng)進行質(zhì)量檢驗。

2、PH 測定及調(diào)節(jié)：PH測定要在培養(yǎng)基冷至室溫時進行，因在熱或冷的情況下，其PH有一定差異，當測定好時，按計算量加入堿或酸混勻后，應(yīng)再測試一次。培養(yǎng)基 PH值一定要準確，否則會影響微生物的生長或影響結(jié)果的觀察。但需注意因高壓滅菌可 影響一些培養(yǎng)基的 PH 降低或升高，故不宜滅菌壓力過高或次數(shù)太多，以免影響培養(yǎng)基 的質(zhì)量，指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等一般在調(diào)完P(guān)H后再加入。

3、培養(yǎng)基需保持澄清，便于觀察細菌的生長情況，培養(yǎng)基加熱煮沸后，可用脫脂棉 花或絨布過濾，以除去沉淀物，必要時可用雞蛋白澄清處理，所用瓊脂條要預(yù)先洗凈晾干后使用，避免因瓊脂含雜質(zhì)而影響透明度。

4、盛裝培養(yǎng)基不宜用鐵、銅等容器，使用洗凈的中性硬質(zhì)玻璃容器為好。

5、培養(yǎng)基的滅菌既要達到*滅菌目的，又要注意不因加熱而降低其營養(yǎng)價值，一般121℃15min即可，如為含有不耐高熱物質(zhì)的培養(yǎng)基如糖類、血清、明膠等，則應(yīng)采用低溫滅菌或間歇法滅菌，一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等，待基礎(chǔ)瓊脂高壓滅菌后涼至50℃左右再加入。

6、每批培養(yǎng)基制備好后，應(yīng)做無菌生長試驗及所檢菌株生長試驗。如果是生化培養(yǎng)基，使用標準菌株接種培養(yǎng)，觀察生化反應(yīng)結(jié)果，應(yīng)呈正常反應(yīng)，培養(yǎng)基不應(yīng)貯存過久，必要時可置4℃冰箱存放。

7、目前各種干燥培養(yǎng)基較多，每批需用標準菌株進行生長試驗或生化反應(yīng)觀察，各種培養(yǎng)基用相應(yīng)菌株生長試驗良好后方可應(yīng)用，新購進的或存放過久的干燥培養(yǎng)基，在配制時也應(yīng)測PH，使用時需根據(jù)產(chǎn)品說明書用量和方法進行。

8、每批制備的培養(yǎng)基所用化學(xué)試劑、滅菌情況及菌株生長試驗結(jié)果、制作人員等應(yīng)做好記錄，以備查詢。


六、記錄和報告的要求
1、檢驗室收到樣品后，首行外觀檢驗，及時按照國家標準檢驗方法進行檢驗， 檢驗過程中要認真、負責、嚴格進行無菌操作，避免環(huán)境中微生物污染。

2、樣品檢驗過程中所用方法、出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果等均要用文字寫出試驗紀錄，以作為對結(jié)果分析、判定的依據(jù)，記錄要求詳細、清楚、真實、客觀、不得涂改和偽造。

七、無菌操作要求

1. 接種細菌時必須穿工作服、戴工作帽。
     
2. 進行接種食品樣品時，必須穿的工作服、帽及拖鞋，應(yīng)放在無菌室緩沖間， 工作前經(jīng)紫外線消毒后使用。  
   
3. 接種食品樣品時，應(yīng)在進無菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簟?/span>
     
4. 進行接種所用的吸管，平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點燃燒灼三次后使用。       

5. 從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時，吸管尖不得觸及試管或平皿邊。
      
6. 接種樣品、轉(zhuǎn)種細菌必須在酒精燈前操作，接種細菌或樣品時，吸管從包裝中取 出后及打開試管塞都要通過火焰消毒。 
    
7. 接種環(huán)和針在接種細菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必要時還要燒到環(huán)和針與桿的連接處，接種結(jié)核菌和烈性菌的接種環(huán)應(yīng)在沸水中煮沸5min，再經(jīng)火焰燒灼。

8. 吸管吸取菌液或樣品時，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。