微生物實驗室技術

一、

器皿的包扎

為了使滅菌后仍保持無菌狀態(tài)，各種玻璃器皿均需包扎。

1、培養(yǎng)皿：洗滌烘干后的培養(yǎng)皿每5~8套作為一包，用牢固的紙卷成一筒，外面用繩子捆扎，以免散開，然后進行滅菌。至使用時才能在無菌室中打開取出。

2、吸管：洗凈烘干后的吸管，在吸管的粗頭頂端用尖頭鑷子或針塞入少許脫脂棉花，約1.5cm長，以防止菌體誤吸入口中的微生物吹入吸管而進入培養(yǎng)物中造成污染。塞入棉花的量要適宜，棉花不宜露在吸管外面，多余的棉花可用酒精燈的火焰把它燒掉。每根吸管用一條寬約4~5cm的紙條，以45°左右的角度螺旋形卷起來。吸管的尖-端在頭部，吸管的另一端用剩余的紙條折疊打結(jié)以免散開，標上容量。滅菌后，要在使用時才從吸管中間擰斷紙條抽取吸管，或用雙層白棉布做成長度適宜的袋子，若干支吸管裝成一袋，吸管的尖-端在布袋的封口處，吸口在袋口處，裝好后將袋口扎緊，滅菌。

注意，布袋裝吸管時不宜用于熱滅菌法滅菌。

3、試管和三角燒瓶：試管要用合適的棉花塞，棉花塞起過濾作用，避免空氣中的微生物進入試管。要求使棉花塞緊貼玻璃壁，沒有皺紋和縫隙，不能過緊也不能過松。過緊易擠破管口，過松易掉落和污染。棉花塞的長度不小于直徑的二倍，約2/3塞進管中。

若干支試管用繩扎在一起，在棉花塞部分用牛皮紙包裹，在紙外用繩扎緊后滅菌。每個三角瓶用雙層牛皮紙將瓶口包裹然后用棉繩扎緊。

二、

玻璃器皿的洗滌

微生物學實驗中，常有的玻璃器皿、三角燒瓶、試管、吸管等洗滌是否干凈，滅菌是否*，對實驗結(jié)果的正確性有直接的影響。洗滌后的器皿應達到玻璃壁能被水均勻潤濕而無條紋和水珠。

1、新玻璃器皿的洗滌：新玻璃器皿常略帶堿性，使用前應先用1~2%HCl水溶液（體積分數(shù)）浸泡數(shù)小時或過夜，再用洗衣粉或洗潔精洗滌，然后用清水洗凈，必要時再用蒸餾水沖洗，倒立于晾干架上或烘干。

2、一般玻璃器皿的洗滌：一般器皿用完后，立即用洗潔精浸泡，用毛刷刷洗，并用清水沖凈。如粘污有細菌培養(yǎng)物的器皿應進行高壓滅菌后再刷洗。滅菌前不要隨意堆放。

3、難洗器皿的洗滌：難洗的器皿不要與易洗滌的器皿混在一起。有油的器皿不要與無油的器皿混在一起，否則使本來無油的器皿也粘上油污，浪費洗滌劑和時間。

三、無菌操作的基本原則

1、無菌室應當經(jīng)常打掃，用來蘇水擦洗桌面、臺面及墻壁。無菌室在使用前，用紫外線燈照射30min進行空氣消毒。

2、進入無菌室前先洗手，在緩沖間內(nèi)換上干凈并經(jīng)紫外線燈照射過的工作衣、工作帽、口-罩及工作鞋。工作鞋只準在無菌室內(nèi)使用，不準穿到其它地方去。

3、樣品及無菌物打開后，操作者在操作時應于樣品及無菌物保持一定的距離；未經(jīng)消毒的手及物品不可直接接觸樣品及無菌樣品；樣品及無菌物不可在空氣中暴露過久，操作要正確、迅速；取樣時必須用無菌鉗或無菌鑷子，手臂不可從樣品及無菌物面上橫過；從無菌容器中或樣品中取出的物品即使未被污染，也不能放回原處。

4、無菌物品應分類放置于固定地點，并定期檢查，不可與未滅菌的物品混放在一起。

5、不能在無菌室內(nèi)談笑，盡量少走動。

6、無菌室應定期熏蒸消毒。

第四節(jié)   常用微生物檢驗儀器及器皿

一、電熱恒溫水浴鍋

1、構造：水浴箱分內(nèi)外兩層，內(nèi)層用鋁板制成，槽底安裝銅管，內(nèi)裝電阻絲，用瓷接線柱連通兩股導線至控制器?？刂破饔蔁衢_關及電路組成，外殼用薄鋼板制成。表面烤漆覆蓋，內(nèi)壁用隔熱材料制成?？刂破鞯娜侩娖鞑考b在電器箱內(nèi)?？刂破鞅砻嬗须娫撮_關、調(diào)溫按鈕和指示燈。在水箱左下側(cè)有放水閥門，在水箱后上側(cè)可插溫度計。

2、使用方法

①關閉放水閥門，將水浴箱內(nèi)注入清水至適當深度。

②安裝地線，接通電源線。

③順時針調(diào)節(jié)調(diào)溫旋鈕到適當位置。

④開啟電源，紅燈亮顯示電阻絲通電加熱。

⑤電阻絲加熱后溫度計的指數(shù)上升到離預定溫度約2℃時，應反向轉(zhuǎn)動調(diào)溫旋鈕至紅燈熄滅，此后紅燈不斷熄亮，表示溫控在起作用，這時再略微調(diào)節(jié)調(diào)溫旋鈕即可達到預定溫度。

3、注意事項

①水位要保持不低于電熱管，否則會立即燒壞電熱管。

②控制箱內(nèi)部不可受潮濕，以防漏電。

③使用時注意水箱是否有滲漏現(xiàn)象。

二、培養(yǎng)箱

培養(yǎng)箱亦稱保溫箱，是培養(yǎng)微生物的主要儀器。

1、構造：培養(yǎng)箱是一般為方形或長方形，以鐵皮噴漆制成外殼，鉛板作內(nèi)壁，夾層充以石棉或玻璃棉等絕緣材料以防溫度擴散。內(nèi)層底下安裝電阻絲用以加熱，利用空氣對流，使箱內(nèi)溫度均勻。箱內(nèi)設有金屬孔架數(shù)層，用以擱置培養(yǎng)材料。箱門雙重，內(nèi)設玻璃門，便于觀看箱內(nèi)標本，外為金屬門。每次取放培養(yǎng)物時，均應盡快進行，以免影響恒溫。箱頂裝有一支溫度計，可以測知箱內(nèi)溫度。箱壁裝有溫度調(diào)節(jié)器可以調(diào)節(jié)溫度。根據(jù)使用需要，檢驗室可常設37℃、44℃、28℃恒溫箱各一個。

2、操作方法與維護

①先開箱門，接通電源，加熱到所需溫度，待用。

②箱內(nèi)不應放入過熱或過冷之物，取放物品時，應隨手關閉箱門，以維持恒溫。

③箱內(nèi)可放入裝水容器一只，以維持箱內(nèi)濕度和減少培養(yǎng)物中的水分大量蒸發(fā)。

④培養(yǎng)箱zui底層溫度較高，培養(yǎng)物不應直接與之接觸。箱內(nèi)培養(yǎng)物不應放置過擠，以保證培養(yǎng)和受溫均勻。各層金屬孔上放置物品不應過重，以免將金屬孔架壓彎滑脫，打碎培養(yǎng)標本。

⑤可每月進行箱內(nèi)消毒一次。方法為斷電后，先用3%（體積分數(shù)）的來蘇水溶液涂布消毒，再用清水抹布擦凈。

⑥培養(yǎng)用恒溫箱，不準作烘干衣帽等其它用途。

三、超凈工作臺

超凈工作臺是一種局部層流（平行流）裝置，它能在局部造成高潔凈度的環(huán)境。超凈工作臺的操作方法與注意事項如下：

1、超凈工作臺用三相四線380v電源，通電后檢查風機轉(zhuǎn)向是否正確，風機轉(zhuǎn)向不對，則風速很小，將電源輸入線調(diào)整即可。

2、使用前30min打開紫外線殺菌燈，對工作區(qū)域進行照射，把細菌病毒全部殺死。

3、使用*min將通風機啟動。臺面用海綿或白紗布擦干凈。

4、操作時把開關按鈕撥在照明處，操作室殺菌燈即熄滅。

5、操作區(qū)為層流區(qū)，因此物品的放置不應妨礙氣流的正常流動，工作人員應盡量避免能引起擾亂氣流的動作，以免造成人身污染。

6、操作者應穿著潔凈工作服、工作鞋、戴好口-罩。

7、工作完畢后停止風機運行，把防塵簾放下。

8、使用過程如發(fā)現(xiàn)問題應立即切斷電源，報修理人員檢查維修。

9、超凈工作臺安裝的地方應遠離有振動及噪聲大的地方，以防止振動對它的影響，若周圍有振動，應采取措施。

10、每3~6個月用儀器檢查超凈工作臺性能有無變化，測試整機風速時，采用熱球式風速儀（QDF—2型）。如操作區(qū)風速低于0.2m/s，應對初、中、高三級過濾器逐級做清洗除塵處理。一般連續(xù)使用6個月后，定期將泡沫塑料進行清洗，用10%純堿溶液（質(zhì)量分數(shù)）浸泡8小時后，用清水漂洗干凈。測試振動時采用CZI晶體管測振儀。

11、搬運時必須十分小心，防止碰擊，并注意將通風機底座托起，以免損傷。

四、顯微鏡

1、光學顯微鏡的構造：顯微鏡的基本構造包括光學部分和機械部分。

①光學部分

A、目鏡：裝在鏡筒上端，其上刻有放大倍數(shù)，常用的有5倍（5×）、10倍（10×）及15倍（15×）。為了指示物像，境中可自裝黑色細絲一條，通常使用一段頭發(fā)作為指針。

B、物鏡：顯微鏡zui主要的光學裝置位于鏡筒下端。普通光學顯微鏡一般裝有三個物鏡，分別為低倍鏡(4~10倍)、高倍鏡(40~45倍)和油鏡倍鏡(90~100倍)。各物鏡的放大倍數(shù)也可由外形辨認，鏡頭長度越長，放大倍數(shù)越大；反之，放大倍數(shù)越小。

C、集光器：位于載物臺下方，可上下移動，起調(diào)節(jié)和集中光線的作用。

D、反光鏡：裝在顯微鏡下方，有平凹兩面，可自由轉(zhuǎn)動方向，以便將*光線反射至集光器。

②機械部分

A、鏡座：是用來支持顯微鏡，呈馬蹄形，在顯微鏡的底部。

B、鏡臂：在鏡座上面和鏡筒后面，呈圓弧形，為顯微鏡移動時的握持部分。

C、鏡筒：在顯微鏡的前方上部，是一個金屬制空心圓筒，光線可從此通過。圓筒的上端可插入接目鏡。

D、旋轉(zhuǎn)器：在鏡筒下端與螺紋口相接，有3~4個孔，用于裝備不同放大倍數(shù)接物鏡。

E、載物臺：在鏡筒下方，呈圓形或方形，中間有孔可透過光線。臺上有用來固定標本的彈簧夾，彈簧夾連接推進器，捻動其上的螺旋，能使標本前后左右移動。

F、升降調(diào)節(jié)器：在鏡筒后方兩側(cè)，分粗、細調(diào)節(jié)兩組，用來調(diào)節(jié)鏡筒高低位置，使物鏡聚焦準確。

G、傾斜開關：介于鏡臂和鏡座之間，為鏡筒作前后變化時的支撐點。

H、光圈：在集光器下方，可以任意開閉，用來調(diào)節(jié)射入集光器的光線。

I、次臺：位于載物臺下，次臺上安有集光器、光圈。

2、光學顯微鏡的工作原理：普通光學顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來放大成像。一般微生物學使用的顯微鏡有三個物鏡，其中油鏡對微生物學研究zui為重要。油鏡的分辨力可達到0.2µm左右。大部分細菌的直徑在0.5µm以上，所以油鏡更能看清細菌的個體形態(tài)。

3、暗視野顯微鏡的原理：暗視野顯微鏡的名稱源于它使用一種特殊的暗視野聚光器。在此聚光器中央有一光檔。使光線僅由邊緣進入并匯聚于載玻片上，斜照物體，使物體表面的反射光進入物鏡。所以我們在黑暗的背景中看到的只是物體受光的側(cè)面，是它邊緣發(fā)亮的輪廓。

使用暗視野顯微鏡的時候，只需將光學顯微鏡上的聚光器取下，換上暗視野聚光器即可。暗視野顯微鏡的分辨力比普通光學顯微鏡大。暗視野顯微鏡的適于觀察視野中由于反差過小不易觀察而折射率很強的物體，以及觀察一些小于顯微鏡分辨極限的微小顆粒或鞭毛等。故常用于觀察未染色活菌的運動和鞭毛。

4、顯微鏡的使用

1）觀察前的準備

顯微鏡的使用應按以下順序進行：安置→調(diào)光源→調(diào)目鏡→調(diào)聚光器→低倍鏡→高倍鏡→油鏡→擦鏡→復原

①顯微鏡的安置：置顯微鏡于平整的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊緣約10cm左右，鏡檢時姿勢要端正。

②光源調(diào)節(jié)：安裝在鏡座內(nèi)的光源燈可通過調(diào)節(jié)電壓以獲得適當?shù)恼彰髁炼?，若使用反光鏡采集自然光或燈光作為照明光源時，應根據(jù)光源的強度及所用物鏡的放大倍數(shù)選用凹面或平面反光鏡并調(diào)節(jié)其角度，使視野內(nèi)的光線均勻，亮度適宜。

③雙筒顯微鏡的目鏡調(diào)節(jié)：根據(jù)使用者的個人情況，雙筒顯微鏡的目鏡間距可以適當調(diào)節(jié)，而左目鏡上一般還配有屈光度調(diào)節(jié)環(huán)，可以適應眼距不同或兩眼視力有差異的不同觀察者。

④聚光器數(shù)值孔徑值的調(diào)節(jié)：正確使用聚光鏡才能提高鏡檢效果。聚光鏡的主要參數(shù)是數(shù)值孔徑，它有一定的可變范圍。一般聚光鏡邊框上的數(shù)字代表它的zui大數(shù)值孔徑，通過調(diào)節(jié)聚光鏡下面可變光欄的開放程度，可以得到各種不同的數(shù)值孔徑，以適應不同物鏡的需要。

2）顯微觀察：進行顯微觀察時應遵守從低倍鏡到高倍鏡再到油鏡的觀察順序。

①低倍鏡觀察：將金黃色葡萄球菌染色標本玻片置于載物臺上，用標本夾夾住，移動推進器使觀察對象處在物鏡的正下方。下降10倍物鏡，使其接近標本，用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒，使標本在視野中初步聚焦，再用細調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)使物像至清晰。通過玻片夾推進器慢慢移動玻片，認真觀察標本各部位，找到合適的目的物，仔細觀察并記錄所觀察到的結(jié)果。

②高倍鏡觀察：在低倍鏡下找到合適的觀察目標，并將其移至視野中心后，將高倍鏡移至中心位置。對聚光器光圈及視野亮度進行適當調(diào)節(jié)后微調(diào)細調(diào)節(jié)器使物像清晰，利用推進器移動標本找到需要觀察的部位，并移至視野中心仔細觀察或準備用油鏡觀察

③油鏡觀察：在高倍鏡或低倍鏡找到要觀察的樣品區(qū)域后，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒升高，然后將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。在待觀察的樣品區(qū)域加滴香柏油，從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心的將下，使油鏡浸在油中，并幾乎于標本接觸時止（注意：切不可將油鏡壓到標本，否則不僅壓碎玻片，還會損壞鏡頭）。將聚光器升至zui高位置并開足光圈（若所用聚光器的數(shù)值孔徑值超過1.0，還應在聚光鏡與載玻片之間也加滴香柏油，保證其達到的效能），調(diào)節(jié)照明使視野的亮度合適，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野中出現(xiàn)物像并用細調(diào)節(jié)器使其清晰準焦為止。

3）顯微鏡用后的處理及維護

①上升鏡筒，取下載波片。先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸取少許二甲苯擦去鏡頭上的殘留油跡，然后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，zui后用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，再向下旋。同時把聚光鏡將下以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險，套上鏡套，放回原處。

②顯微鏡是很貴重和精密的儀器，使用是要十分愛惜，各部件不要隨意拆卸。搬動顯微鏡時應一手托鏡座，一手握鏡臂，放于胸前，以免損壞。

③顯微鏡放置的地方要干燥，以免鏡片生霉；亦要避免灰塵，在箱外放置暫時不用時，要用紗布等蓋住鏡體。顯微鏡應避免陽光曝曬，并須遠離熱源。