微生物實(shí)驗(yàn)室技術(shù)

一、

器皿的包扎

為了使滅菌后仍保持無(wú)菌狀態(tài)，各種玻璃器皿均需包扎。

1、培養(yǎng)皿：洗滌烘干后的培養(yǎng)皿每5~8套作為一包，用牢固的紙卷成一筒，外面用繩子捆扎，以免散開，然后進(jìn)行滅菌。至使用時(shí)才能在無(wú)菌室中打開取出。

2、吸管：洗凈烘干后的吸管，在吸管的粗頭頂端用尖頭鑷子或針塞入少許脫脂棉花，約1.5cm長(zhǎng)，以防止菌體誤吸入口中的微生物吹入吸管而進(jìn)入培養(yǎng)物中造成污染。塞入棉花的量要適宜，棉花不宜露在吸管外面，多余的棉花可用酒精燈的火焰把它燒掉。每根吸管用一條寬約4~5cm的紙條，以45°左右的角度螺旋形卷起來(lái)。吸管的尖-端在頭部，吸管的另一端用剩余的紙條折疊打結(jié)以免散開，標(biāo)上容量。滅菌后，要在使用時(shí)才從吸管中間擰斷紙條抽取吸管，或用雙層白棉布做成長(zhǎng)度適宜的袋子，若干支吸管裝成一袋，吸管的尖-端在布袋的封口處，吸口在袋口處，裝好后將袋口扎緊，滅菌。

注意，布袋裝吸管時(shí)不宜用于熱滅菌法滅菌。

3、試管和三角燒瓶：試管要用合適的棉花塞，棉花塞起過(guò)濾作用，避免空氣中的微生物進(jìn)入試管。要求使棉花塞緊貼玻璃壁，沒(méi)有皺紋和縫隙，不能過(guò)緊也不能過(guò)松。過(guò)緊易擠破管口，過(guò)松易掉落和污染。棉花塞的長(zhǎng)度不小于直徑的二倍，約2/3塞進(jìn)管中。

若干支試管用繩扎在一起，在棉花塞部分用牛皮紙包裹，在紙外用繩扎緊后滅菌。每個(gè)三角瓶用雙層牛皮紙將瓶口包裹然后用棉繩扎緊。

二、

玻璃器皿的洗滌

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常有的玻璃器皿、三角燒瓶、試管、吸管等洗滌是否干凈，滅菌是否*，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性有直接的影響。洗滌后的器皿應(yīng)達(dá)到玻璃壁能被水均勻潤(rùn)濕而無(wú)條紋和水珠。

1、新玻璃器皿的洗滌：新玻璃器皿常略帶堿性，使用前應(yīng)先用1~2%HCl水溶液（體積分?jǐn)?shù)）浸泡數(shù)小時(shí)或過(guò)夜，再用洗衣粉或洗潔精洗滌，然后用清水洗凈，必要時(shí)再用蒸餾水沖洗，倒立于晾干架上或烘干。

2、一般玻璃器皿的洗滌：一般器皿用完后，立即用洗潔精浸泡，用毛刷刷洗，并用清水沖凈。如粘污有細(xì)菌培養(yǎng)物的器皿應(yīng)進(jìn)行高壓滅菌后再刷洗。滅菌前不要隨意堆放。

3、難洗器皿的洗滌：難洗的器皿不要與易洗滌的器皿混在一起。有油的器皿不要與無(wú)油的器皿混在一起，否則使本來(lái)無(wú)油的器皿也粘上油污，浪費(fèi)洗滌劑和時(shí)間。

三、無(wú)菌操作的基本原則

1、無(wú)菌室應(yīng)當(dāng)經(jīng)常打掃，用來(lái)蘇水擦洗桌面、臺(tái)面及墻壁。無(wú)菌室在使用前，用紫外線燈照射30min進(jìn)行空氣消毒。

2、進(jìn)入無(wú)菌室前先洗手，在緩沖間內(nèi)換上干凈并經(jīng)紫外線燈照射過(guò)的工作衣、工作帽、口-罩及工作鞋。工作鞋只準(zhǔn)在無(wú)菌室內(nèi)使用，不準(zhǔn)穿到其它地方去。

3、樣品及無(wú)菌物打開后，操作者在操作時(shí)應(yīng)于樣品及無(wú)菌物保持一定的距離；未經(jīng)消毒的手及物品不可直接接觸樣品及無(wú)菌樣品；樣品及無(wú)菌物不可在空氣中暴露過(guò)久，操作要正確、迅速；取樣時(shí)必須用無(wú)菌鉗或無(wú)菌鑷子，手臂不可從樣品及無(wú)菌物面上橫過(guò)；從無(wú)菌容器中或樣品中取出的物品即使未被污染，也不能放回原處。

4、無(wú)菌物品應(yīng)分類放置于固定地點(diǎn)，并定期檢查，不可與未滅菌的物品混放在一起。

5、不能在無(wú)菌室內(nèi)談笑，盡量少走動(dòng)。

6、無(wú)菌室應(yīng)定期熏蒸消毒。

第四節(jié)   常用微生物檢驗(yàn)儀器及器皿

一、電熱恒溫水浴鍋

1、構(gòu)造：水浴箱分內(nèi)外兩層，內(nèi)層用鋁板制成，槽底安裝銅管，內(nèi)裝電阻絲，用瓷接線柱連通兩股導(dǎo)線至控制器?？刂破饔蔁衢_關(guān)及電路組成，外殼用薄鋼板制成。表面烤漆覆蓋，內(nèi)壁用隔熱材料制成。控制器的全部電器部件均裝在電器箱內(nèi)。控制器表面有電源開關(guān)、調(diào)溫按鈕和指示燈。在水箱左下側(cè)有放水閥門，在水箱后上側(cè)可插溫度計(jì)。

2、使用方法

①關(guān)閉放水閥門，將水浴箱內(nèi)注入清水至適當(dāng)深度。

②安裝地線，接通電源線。

③順時(shí)針調(diào)節(jié)調(diào)溫旋鈕到適當(dāng)位置。

④開啟電源，紅燈亮顯示電阻絲通電加熱。

⑤電阻絲加熱后溫度計(jì)的指數(shù)上升到離預(yù)定溫度約2℃時(shí)，應(yīng)反向轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)溫旋鈕至紅燈熄滅，此后紅燈不斷熄亮，表示溫控在起作用，這時(shí)再略微調(diào)節(jié)調(diào)溫旋鈕即可達(dá)到預(yù)定溫度。

3、注意事項(xiàng)

①水位要保持不低于電熱管，否則會(huì)立即燒壞電熱管。

②控制箱內(nèi)部不可受潮濕，以防漏電。

③使用時(shí)注意水箱是否有滲漏現(xiàn)象。

二、培養(yǎng)箱

培養(yǎng)箱亦稱保溫箱，是培養(yǎng)微生物的主要儀器。

1、構(gòu)造：培養(yǎng)箱是一般為方形或長(zhǎng)方形，以鐵皮噴漆制成外殼，鉛板作內(nèi)壁，夾層充以石棉或玻璃棉等絕緣材料以防溫度擴(kuò)散。內(nèi)層底下安裝電阻絲用以加熱，利用空氣對(duì)流，使箱內(nèi)溫度均勻。箱內(nèi)設(shè)有金屬孔架數(shù)層，用以擱置培養(yǎng)材料。箱門雙重，內(nèi)設(shè)玻璃門，便于觀看箱內(nèi)標(biāo)本，外為金屬門。每次取放培養(yǎng)物時(shí)，均應(yīng)盡快進(jìn)行，以免影響恒溫。箱頂裝有一支溫度計(jì)，可以測(cè)知箱內(nèi)溫度。箱壁裝有溫度調(diào)節(jié)器可以調(diào)節(jié)溫度。根據(jù)使用需要，檢驗(yàn)室可常設(shè)37℃、44℃、28℃恒溫箱各一個(gè)。

2、操作方法與維護(hù)

①先開箱門，接通電源，加熱到所需溫度，待用。

②箱內(nèi)不應(yīng)放入過(guò)熱或過(guò)冷之物，取放物品時(shí)，應(yīng)隨手關(guān)閉箱門，以維持恒溫。

③箱內(nèi)可放入裝水容器一只，以維持箱內(nèi)濕度和減少培養(yǎng)物中的水分大量蒸發(fā)。

④培養(yǎng)箱zui底層溫度較高，培養(yǎng)物不應(yīng)直接與之接觸。箱內(nèi)培養(yǎng)物不應(yīng)放置過(guò)擠，以培養(yǎng)和受溫均勻。各層金屬孔上放置物品不應(yīng)過(guò)重，以免將金屬孔架壓彎滑脫，打碎培養(yǎng)標(biāo)本。

⑤可每月進(jìn)行箱內(nèi)消毒一次。方法為斷電后，先用3%（體積分?jǐn)?shù)）的來(lái)蘇水溶液涂布消毒，再用清水抹布擦凈。

⑥培養(yǎng)用恒溫箱，不準(zhǔn)作烘干衣帽等其它用途。

三、超凈工作臺(tái)

超凈工作臺(tái)是一種局部層流（平行流）裝置，它能在局部造成高潔凈度的環(huán)境。超凈工作臺(tái)的操作方法與注意事項(xiàng)如下：

1、超凈工作臺(tái)用三相四線380v電源，通電后檢查風(fēng)機(jī)轉(zhuǎn)向是否正確，風(fēng)機(jī)轉(zhuǎn)向不對(duì)，則風(fēng)速很小，將電源輸入線調(diào)整即可。

2、使用前30min打開紫外線殺菌燈，對(duì)工作區(qū)域進(jìn)行照射，把細(xì)菌病毒全部殺死。

3、使用*min將通風(fēng)機(jī)啟動(dòng)。臺(tái)面用海綿或白紗布擦干凈。

4、操作時(shí)把開關(guān)按鈕撥在照明處，操作室殺菌燈即熄滅。

5、操作區(qū)為層流區(qū)，因此物品的放置不應(yīng)妨礙氣流的正常流動(dòng)，工作人員應(yīng)盡量避免能引起擾亂氣流的動(dòng)作，以免造成人身污染。

6、操作者應(yīng)穿著潔凈工作服、工作鞋、戴好口-罩。

7、工作完畢后停止風(fēng)機(jī)運(yùn)行，把防塵簾放下。

8、使用過(guò)程如發(fā)現(xiàn)問(wèn)題應(yīng)立即切斷電源，報(bào)修理人員檢查維修。

9、超凈工作臺(tái)安裝的地方應(yīng)遠(yuǎn)離有振動(dòng)及噪聲大的地方，以防止振動(dòng)對(duì)它的影響，若周圍有振動(dòng)，應(yīng)采取措施。

10、每3~6個(gè)月用儀器檢查超凈工作臺(tái)性能有無(wú)變化，測(cè)試整機(jī)風(fēng)速時(shí)，采用熱球式風(fēng)速儀（QDF—2型）。如操作區(qū)風(fēng)速低于0.2m/s，應(yīng)對(duì)初、中、高三級(jí)過(guò)濾器逐級(jí)做清洗除塵處理。一般連續(xù)使用6個(gè)月后，定期將泡沫塑料進(jìn)行清洗，用10%純堿溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）浸泡8小時(shí)后，用清水漂洗干凈。測(cè)試振動(dòng)時(shí)采用CZI晶體管測(cè)振儀。

11、搬運(yùn)時(shí)必須十分小心，防止碰擊，并注意將通風(fēng)機(jī)底座托起，以免損傷。

四、顯微鏡

1、光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造：顯微鏡的基本構(gòu)造包括光學(xué)部分和機(jī)械部分。

①光學(xué)部分

A、目鏡：裝在鏡筒上端，其上刻有放大倍數(shù)，常用的有5倍（5×）、10倍（10×）及15倍（15×）。為了指示物像，境中可自裝黑色細(xì)絲一條，通常使用一段頭發(fā)作為指針。

B、物鏡：顯微鏡zui主要的光學(xué)裝置位于鏡筒下端。普通光學(xué)顯微鏡一般裝有三個(gè)物鏡，分別為低倍鏡(4~10倍)、高倍鏡(40~45倍)和油鏡倍鏡(90~100倍)。各物鏡的放大倍數(shù)也可由外形辨認(rèn)，鏡頭長(zhǎng)度越長(zhǎng)，放大倍數(shù)越大；反之，放大倍數(shù)越小。

C、集光器：位于載物臺(tái)下方，可上下移動(dòng)，起調(diào)節(jié)和集中光線的作用。

D、反光鏡：裝在顯微鏡下方，有平凹兩面，可自由轉(zhuǎn)動(dòng)方向，以便將*光線反射至集光器。

②機(jī)械部分

A、鏡座：是用來(lái)支持顯微鏡，呈馬蹄形，在顯微鏡的底部。

B、鏡臂：在鏡座上面和鏡筒后面，呈圓弧形，為顯微鏡移動(dòng)時(shí)的握持部分。

C、鏡筒：在顯微鏡的前方上部，是一個(gè)金屬制空心圓筒，光線可從此通過(guò)。圓筒的上端可插入接目鏡。

D、旋轉(zhuǎn)器：在鏡筒下端與螺紋口相接，有3~4個(gè)孔，用于裝備不同放大倍數(shù)接物鏡。

E、載物臺(tái)：在鏡筒下方，呈圓形或方形，中間有孔可透過(guò)光線。臺(tái)上有用來(lái)固定標(biāo)本的彈簧夾，彈簧夾連接推進(jìn)器，捻動(dòng)其上的螺旋，能使標(biāo)本前后左右移動(dòng)。

F、升降調(diào)節(jié)器：在鏡筒后方兩側(cè)，分粗、細(xì)調(diào)節(jié)兩組，用來(lái)調(diào)節(jié)鏡筒高低位置，使物鏡聚焦準(zhǔn)確。

G、傾斜開關(guān)：介于鏡臂和鏡座之間，為鏡筒作前后變化時(shí)的支撐點(diǎn)。

H、光圈：在集光器下方，可以任意開閉，用來(lái)調(diào)節(jié)射入集光器的光線。

I、次臺(tái)：位于載物臺(tái)下，次臺(tái)上安有集光器、光圈。

2、光學(xué)顯微鏡的工作原理：普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來(lái)放大成像。一般微生物學(xué)使用的顯微鏡有三個(gè)物鏡，其中油鏡對(duì)微生物學(xué)研究zui為重要。油鏡的分辨力可達(dá)到0.2µm左右。大部分細(xì)菌的直徑在0.5µm以上，所以油鏡更能看清細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)。

3、暗視野顯微鏡的原理：暗視野顯微鏡的名稱源于它使用一種特殊的暗視野聚光器。在此聚光器中央有一光檔。使光線僅由邊緣進(jìn)入并匯聚于載玻片上，斜照物體，使物體表面的反射光進(jìn)入物鏡。所以我們?cè)诤诎档谋尘爸锌吹降闹皇俏矬w受光的側(cè)面，是它邊緣發(fā)亮的輪廓。

使用暗視野顯微鏡的時(shí)候，只需將光學(xué)顯微鏡上的聚光器取下，換上暗視野聚光器即可。暗視野顯微鏡的分辨力比普通光學(xué)顯微鏡大。暗視野顯微鏡的適于觀察視野中由于反差過(guò)小不易觀察而折射率的物體，以及觀察一些小于顯微鏡分辨極限的微小顆粒或鞭毛等。故常用于觀察未染色活菌的運(yùn)動(dòng)和鞭毛。

4、顯微鏡的使用

1）觀察前的準(zhǔn)備

顯微鏡的使用應(yīng)按以下順序進(jìn)行：安置→調(diào)光源→調(diào)目鏡→調(diào)聚光器→低倍鏡→高倍鏡→油鏡→擦鏡→復(fù)原

①顯微鏡的安置：置顯微鏡于平整的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊緣約10cm左右，鏡檢時(shí)姿勢(shì)要端正。

②光源調(diào)節(jié)：安裝在鏡座內(nèi)的光源燈可通過(guò)調(diào)節(jié)電壓以獲得適當(dāng)?shù)恼彰髁炼?，若使用反光鏡采集自然光或燈光作為照明光源時(shí)，應(yīng)根據(jù)光源的強(qiáng)度及所用物鏡的放大倍數(shù)選用凹面或平面反光鏡并調(diào)節(jié)其角度，使視野內(nèi)的光線均勻，亮度適宜。

③雙筒顯微鏡的目鏡調(diào)節(jié)：根據(jù)使用者的個(gè)人情況，雙筒顯微鏡的目鏡間距可以適當(dāng)調(diào)節(jié)，而左目鏡上一般還配有屈光度調(diào)節(jié)環(huán)，可以適應(yīng)眼距不同或兩眼視力有差異的不同觀察者。

④聚光器數(shù)值孔徑值的調(diào)節(jié)：正確使用聚光鏡才能提高鏡檢效果。聚光鏡的主要參數(shù)是數(shù)值孔徑，它有一定的可變范圍。一般聚光鏡邊框上的數(shù)字代表它的zui大數(shù)值孔徑，通過(guò)調(diào)節(jié)聚光鏡下面可變光欄的開放程度，可以得到各種不同的數(shù)值孔徑，以適應(yīng)不同物鏡的需要。

2）顯微觀察：進(jìn)行顯微觀察時(shí)應(yīng)遵守從低倍鏡到高倍鏡再到油鏡的觀察順序。

①低倍鏡觀察：將金黃色葡萄球菌染色標(biāo)本玻片置于載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推進(jìn)器使觀察對(duì)象處在物鏡的正下方。下降10倍物鏡，使其接近標(biāo)本，用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒，使標(biāo)本在視野中初步聚焦，再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)使物像至清晰。通過(guò)玻片夾推進(jìn)器慢慢移動(dòng)玻片，認(rèn)真觀察標(biāo)本各部位，找到合適的目的物，仔細(xì)觀察并記錄所觀察到的結(jié)果。

②高倍鏡觀察：在低倍鏡下找到合適的觀察目標(biāo)，并將其移至視野中心后，將高倍鏡移至中心位置。對(duì)聚光器光圈及視野亮度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)后微調(diào)細(xì)調(diào)節(jié)器使物像清晰，利用推進(jìn)器移動(dòng)標(biāo)本找到需要觀察的部位，并移至視野中心仔細(xì)觀察或準(zhǔn)備用油鏡觀察

③油鏡觀察：在高倍鏡或低倍鏡找到要觀察的樣品區(qū)域后，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒升高，然后將油鏡轉(zhuǎn)到工作位置。在待觀察的樣品區(qū)域加滴香柏油，從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心的將下，使油鏡浸在油中，并幾乎于標(biāo)本接觸時(shí)止（注意：切不可將油鏡壓到標(biāo)本，否則不僅壓碎玻片，還會(huì)損壞鏡頭）。將聚光器升至zui高位置并開足光圈（若所用聚光器的數(shù)值孔徑值超過(guò)1.0，還應(yīng)在聚光鏡與載玻片之間也加滴香柏油，其達(dá)到的效能），調(diào)節(jié)照明使視野的亮度合適，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野中出現(xiàn)物像并用細(xì)調(diào)節(jié)器使其清晰準(zhǔn)焦為止。

3）顯微鏡用后的處理及維護(hù)

①上升鏡筒，取下載波片。先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸取少許二甲苯擦去鏡頭上的殘留油跡，然后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，zui后用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形，再向下旋。同時(shí)把聚光鏡將下以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險(xiǎn)，套上鏡套，放回原處。

②顯微鏡是很貴重和精密的儀器，使用是要十分愛(ài)惜，各部件不要隨意拆卸。搬動(dòng)顯微鏡時(shí)應(yīng)一手托鏡座，一手握鏡臂，放于胸前，以免損壞。

③顯微鏡放置的地方要干燥，以免鏡片生霉；亦要避免灰塵，在箱外放置暫時(shí)不用時(shí)，要用紗布等蓋住鏡體。顯微鏡應(yīng)避免陽(yáng)光曝曬，并須遠(yuǎn)離熱源。