游離脂肪酸（FFA）含量試劑盒（測(cè)血清、動(dòng)物組織、微生物、細(xì)胞） 微量法 100 管/96 樣 正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異的樣本做預(yù)測(cè)定 測(cè)定意義： 游離脂肪酸，也稱為非酯化脂肪酸，在與白蛋白結(jié)合的血漿中循環(huán)。動(dòng)物血液中的游離脂肪 酸 (FFA )含量是一項(xiàng)重要的生理生化指標(biāo)。血清中游離脂肪酸的濃度與脂類代謝、糖代謝、 內(nèi)分泌功能有關(guān)，游離脂肪酸的濃度會(huì)因?yàn)樘悄虿?、重癥肝障礙、功能亢進(jìn)等疾病而 上升。 測(cè)定原理： 用有機(jī)溶劑萃取 FFA。含有 FFA 的有機(jī)液與三乙醇胺銅反應(yīng),在有機(jī)相中形成脂肪酸銅 (銅 皂) FFA 一 Cu。Cu 離子與顯色液反應(yīng)形成紫紅色絡(luò)合物。反應(yīng)形成的顏色深淺與 Cu 離子 濃度的關(guān)系符合朗伯一比爾定律，因此可利用此反應(yīng)進(jìn)行比色。 自備的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96 孔板、蒸餾水。 試劑的組成和配制： 萃取液：液體 120 mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 15 mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：液體 15 mL×1 瓶，4℃保存； 試劑三：粉劑×1 瓶，室溫保存； 試劑四：液體 12 mL×1 瓶，4℃保存； 樣本前處理： 1.動(dòng)物組織：按照動(dòng)物組織質(zhì)量（g）：萃取液 mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組 織，加入 1mL 萃取液），進(jìn)行冰浴勻漿。震蕩提取 15min，5000 rpm 4℃離心 5min，取有 機(jī)相待測(cè)。 2.血清：吸取 50 μL 血清樣本，加入 1 mL 萃取液，震蕩提取 15 min 后，4℃，5000 rpm 離 心 5 min，取有機(jī)相待測(cè)。 3.微生物、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：萃取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建 議 500 萬細(xì)胞加入 1 mL 萃取液）加入萃取液，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 2 秒，間隔 3 秒，總時(shí)間 3min）；震蕩提取 15 min，然后 5000 rpm 4℃離心 5min，取有機(jī)相 待測(cè)。 注意：有機(jī)相待測(cè)液可能存在于上層，也可能存在于下層，注意觀察，體積較多的那一層 即為有機(jī)相待測(cè)液。 測(cè)定步驟： 1、 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 550 nm。 2、 工作液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑一（V）：試劑二（V）：試劑三（m）=1（mL）： 1（mL）：0.66（g）的比例充分混勻。（注意：現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少，在空瓶中配 制，試劑盒中帶有 4 個(gè)空瓶，先將試劑一與試劑二混合，后再加入試劑三粉劑） 3、測(cè)定管：吸取600μL樣本，加入200μL工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃，5000 rpm離 心5 min，分層后取200μL上層有機(jī)相，加入100μL試劑四，搖勻，10 min后測(cè)定550 nm的 吸光值，記為A測(cè)定。 4、空白管：吸取600μL萃取液，加入200μL工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃，5000 rpm離心5 min，分層后取200μL上層有機(jī)相，加入100μL試劑四，搖勻，10 min后測(cè)定550 nm的 吸光值，記為A空白。 空白管只需測(cè)一次。△A=A測(cè)定-A空白 注意：1、有機(jī)溶劑易揮發(fā)，加入96孔板后應(yīng)盡快檢測(cè)。 2、測(cè)定管中加入的樣本即樣本前處理中的有機(jī)相待測(cè)液。 FFA 含量計(jì)算： 標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0161x - 0.0141 R2 = 0.9985 x：棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL） y：吸光值差值△A 1、血清 FFA 含量計(jì)算： FFA 含量(μmol/mL)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000 =1.242×(△A+0.0141) 2、動(dòng)物組織、微生物、細(xì)胞中 FFA 含量計(jì)算： （1）按樣本蛋白濃度計(jì)算 FFA 含量(μmol/g 鮮重)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷（W×V1÷V2）÷1000 =0.062×(△A+0.0141)÷W （2）按樣本蛋白濃度計(jì)算 FFA 含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V1×Cpr)÷1000 =0.062×(△A+0.0141)÷Cpr V1：加入樣本體積，0.6mL；V2：萃取液體積，1mL；V3：加入血清（漿）體積，0.05 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：動(dòng)物組織樣品質(zhì)量，g； 1000：1 μmol=1000 nmol 。 注意事項(xiàng)： 1.蛋白含量不可直接用萃取液提取的有機(jī)相待測(cè)液直接測(cè)定，可用蒸餾水或緩沖液或生理 鹽水選用本公司的 BCA 法蛋白含量測(cè)定試劑盒。 2.zui低檢出限為 20 nmol/mL | 
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