I型膠原蛋白原來是這么使用的，長知識了！

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鼠尾膠原蛋白I型說明書

鼠尾膠原蛋白 I 型(rattailtendon collagen type I)是通過 Birkedal-Hansen 的方法，通過醋酸抽提、氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備的。本公司鼠尾膠原蛋白可用于包被細胞培養(yǎng)器皿，培養(yǎng)一些在普通細胞培養(yǎng)器皿中不易貼壁的細胞。也可用于制備三維膠，模擬真實的生長環(huán)境，使細胞在三維環(huán)境中生長。

1，在使用鼠膠原蛋白 I 型包被的細胞培養(yǎng)皿中檢查到 PC-12 細胞的貼壁和生長。

2，在 1mg/ml 濃度以上，pH 為 7 左右時可形成具有一定強度的三維膠，檢查到 NIH-3T3 細胞在三維膠內(nèi)正

常生長、PC-12 細胞在三維膠表面正常生長。

使用方法：

1、細胞培養(yǎng)器皿的表面包被 濃度： 1-5ug/cm2

以包被濃度為 2 ug/cm2為例：用無菌 0.006mol/L(0.36g/L) 乙酸將膠原蛋白稀釋到 0.012mg/ml。

確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺上過夜晾干。 也可以在室溫放置 1小時后，用PBS洗3-4次后直接使用。包被好的器皿在 4-25℃至少可保存3個月以上的時間。

2、三維膠原的制備

鼠尾膠原蛋白I型在濃度1mg/mL以上，pH 7左右時可形成具有一定強度三維膠，建議成膠濃度1-2mg/mL。膠原蛋白溶解于0.006mol/L 乙酸中，在成膠過程中需要加入0.06×體積的 0.1mol/L NaOH 來中和。

需要的溶液（均需要無菌、預(yù)冷）：10×PBS（可含10 mg/L的酚紅用于pH指示）或10×培養(yǎng)液，0.1mol/L NaOH，0.1mol/L 乙酸(一般不用)，雙蒸水

A． 不含細胞的三維膠原的制備（以配制1mL，1mg/mL三維膠為例）：將200μL鼠尾膠原蛋白I型(5mg/mL)加到置于冰浴的離心管中，加入 690μL H2O。然后加到12μL 0.1mol/L NaOH中（如果反過來把12μL 0.1mol/L NaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)），立即混勻。再加入100μL 10×PBS或10×培養(yǎng)液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中(混勻后pH為7左右，如果PBS或培養(yǎng)液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH試紙測試)。將培養(yǎng)器皿在室溫(25度左右)下放置20分鐘待膠凝固后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。如果配制中使用的是10×PBS，使用前需要加入適當(dāng)體積的細胞培養(yǎng)液預(yù)平衡。

B．含細胞的三維膠原的制備（以配制1 mL，1mg/mL三維膠為例）：準備好懸浮于培養(yǎng)液的細胞，并放置于冰浴中。將200μL鼠尾膠原蛋白I型 (5mg/mL)加到12μL 0.1mol/L NaOH中（如果反過來把12μL 0.1mol/L NaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)），立即混勻。再加入23μL 10×PBS或10×培養(yǎng)液，混勻(混勻后pH為7左右，如果PBS或培養(yǎng)液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH試紙測試)。加入760μL的細胞懸浮液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中。將培養(yǎng)器皿在室溫下放置20分鐘待膠凝固后，加入適當(dāng)體積的細胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注意事項：

鼠尾膠原蛋白I型在室溫下pH中性時可迅速成膠，在操作過程中要盡量保持低溫。

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