免疫熒光雙標(biāo)三色（芯片）

服務(wù)介紹：

組織芯片免疫熒光染色,是將許多不同處理的組織以規(guī)則的微陣列方式排列于同一載體上，同時(shí)進(jìn)行相同指標(biāo)的免疫熒光檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)流程：

1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環(huán)保型脫蠟液10min-環(huán)保型脫蠟液10min-環(huán)保型脫蠟液10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗。

2、 抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。中火8min至沸，停火8min，轉(zhuǎn)中低火7min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。(修復(fù)液和修復(fù)條件根據(jù)組織來確定）

3、 畫圈：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走）

4、 血清封閉:在圈內(nèi)滴加BSA孵育30min。（一抗若是山羊來源，則加驢血清）

5、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，兩種一抗按一定的稀釋比例混合，滴加到組織上，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬標(biāo)記的按一定比例配好的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。（兩種二抗，按照一定的比例混合孵育）

7、 DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

8、 自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后，在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

9、 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

10、鏡檢拍照：切片置于掃描儀下采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm，發(fā)藍(lán)光；FITC激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515-555 nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長(zhǎng)510-560，發(fā)射波長(zhǎng)590nm，發(fā)紅光. CY5激發(fā)波長(zhǎng) 608-648nm, 發(fā)射波長(zhǎng)672-712。 DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，陽(yáng)性表達(dá)為相應(yīng)熒光素標(biāo)記的紅光，綠光 。

送樣運(yùn)輸要求：

　　1.組織樣本放置于20倍樣本體積的固定液中固定24h以上，常溫運(yùn)輸送樣。

　　2.石蠟切片常溫保存運(yùn)輸。