瓊脂糖-重組金黃色-葡萄球菌蛋白 A 親和填料

1 、產(chǎn)品介紹

ProANUPharoseFF 是一款抗體親和填料，FF 為Fast Flow 的縮寫，意味該填料可在高流速下工作。

重組金黃色-葡萄球菌蛋白A 配基由大腸桿菌表達，不含動物來源，保留了野生型的5 個結合域，因而ProANUPharose FF 的載量遠高于野生型蛋白A 填料，對人IgG 的動態(tài)結合載量高于40 mg/mL 。ProANUPharoseFF 對人、小鼠、大鼠、兔、牛等等來源的多種類型和亞型的抗體有親和作用，可從腹水、血清、細胞培養(yǎng)上清或細胞抽提物中分離和純化多種哺乳動物不同亞型的抗體或包含抗體 Fc 片段的基因工程重組蛋白，可滿足不同規(guī)模的研究或生產(chǎn)需求。

2 、產(chǎn)品特點與技術指標

 注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；bDBC10%測試條件為：10%流穿，6 min 停留時間；c 推薦流速是指該流速可滿足大部分柱高下2~6 min 停留時間的使用條件，并非只能在該流速范圍內(nèi)工作；d 10 cm 柱高下的測試流速。

3、抗體親和層析簡介——重組金黃色-葡萄球菌蛋白 A

ProA NUPharose FF 的配基保留了野生型重組金黃色-葡萄球菌蛋白A 的E 、D 、A、B 、C 五個IgG 結合域。每個結構域有58 個氨基酸殘基，以反平行的個α 螺旋排列，所有結構域都能與IgG1、IgG2 和IgG4 的Fc 區(qū)結合，與IgG3 的親和力則非常弱。蛋白A 與IgG 之間的特異性結合源自非共價相互作用，包括在IgG 生理條件的溶液狀態(tài)下的疏水相互作用、極性相互作用和氫鍵。蛋白A 主要與IgG 的Fc 區(qū)結合，不過也有研究證據(jù)表明D 結合域可以與Fab 區(qū)結合。一般需要降低pH 將親和作用破壞后進行洗脫，例如pH=3 的甘-氨酸、檸檬酸鹽和乙酸鹽等。

除了金黃色-葡萄球菌蛋白A，重組鏈球菌蛋白G 也可以與IgG 結合，下表為蛋白A 和蛋白G 對不同哺乳動物不同亞型抗體的結合情況。

注：-表示不結合；+表示微弱結合；++表示中等結合；+++表示很強結合

4 、使用方法參考

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積。ProANUPharoseFF 的壓縮比為1.15。為使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應體積，抽濾除去液體，并用約3 倍填料體積的純化水洗滌，重復3 次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當?shù)娜萜髦校尤脒m量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下 端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時使用裝柱器），為避免引入氣泡，應使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后，用裝柱液將裝柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3 MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定，標記界面穩(wěn)定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標記位置下方與壓縮比對應的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

4.2  柱效測定和評價

完成裝柱后、使用前可通過柱效測定和評價可以確認層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用 理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價。柱效測定可以采用丙酮或者NaCl 作為樣品進行，按照下表配制樣品溶液和流動相。

根據(jù) UV 或者電導率曲線計算理論塔板高度（HETP）、理論塔板數(shù)（N）和非對稱 因子（As），公式如下：

HETP=L/N   

N=5.54(VR/Wh)2 As=a/b

其中：L 為柱高；VR 為保留體積；Wh 為半高峰寬；a 為在 10%峰高處的個半峰寬；b 為在10%峰高處的第二個半峰寬。

一般來說，HETP 的數(shù)值應小于填料平均粒徑的三倍（即HETP/D50<3 ，D50 為填料的平均粒徑），As 應在0.8~1.5 之間。

4.3  平衡與上樣（Equilibration & Loading）

PB 緩沖液（20 mM PB+150 mM NaCl，pH=7.0~7.4）是較為常用和通用的緩沖體系。 初始的緩沖液稱為平衡緩沖液，記為緩沖液 A。

在上樣前，需用緩沖液A 在操作流速下平衡層析柱，該過程通常需要5~10 個柱體積的緩沖液A，以電導、pH 等檢測信號參數(shù)不變且與緩沖液A 對應為準。

上樣量可按“mg  目標蛋白/mL 填料"來設定，通常為 DBC10% 的 50~80%，例如ProA NUPharose FF 產(chǎn)品對人IgG 的DBC10%為~40 mg/mL，上樣量可控制為20~32 mg/mL 。在條件篩選階段，也可以降低上樣品，觀察結合、特異性和洗脫情況。上樣前需要對樣品進行離心（10000 g 以上）、過濾（0.22 或0.45 μm）處理，以免堵塞色譜柱。

上樣后需要 3~10 個柱體積的緩沖液 A 再平衡層析柱。

4.5  在位清洗（CIP）

若發(fā)生柱壓升高，或有蛋白與填料強烈結合無法洗脫，或有沉淀、變性蛋白時，需 要對填料進行在位清洗，可采用以下方法去除雜質(zhì)，反向清洗效果更佳。

 4.6  填料保存

填料的初始保存液為 20%乙醇，使用過后可繼續(xù)用20%乙醇保存。保存溫度在 2~8℃ 為宜，不可凍存。