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線粒體和胞漿蛋白制備試劑盒

線粒體參與能量代謝過程，參與細(xì)胞凋亡與老化等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，參與退行性疾病如帕金森氏病，腫瘤等病理過程。線粒體/胞漿分離試劑盒 （Mitochondria Isolation Kit）用于從組織或培養(yǎng)細(xì)胞中分離線粒體和胞漿成分。加入緩沖液勻漿破碎組織或培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)過數(shù)次800g和12000g離心，在60分鐘內(nèi)即可分離出完整的線粒體和胞漿成分。用于Western Blot、2D-膠、ELISA、酶學(xué)測(cè)定、線粒體蛋白或DNA提取、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究。

制備程序：
1. a. 組織勻漿：稱取50-200 mg新鮮組織如肝臟、腦、心肌等，PBS沖洗，用剪刀剪為0.5cm2碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。估計(jì)組織塊總體積。加入1.5 ml冰預(yù)冷的Mito-Cyto Buffer。上下研磨組織20次。
b. 培養(yǎng)細(xì)胞勻漿：消化細(xì)胞，PBS洗滌，800 × g 5~10 min離心收集細(xì)胞。計(jì)數(shù)。每次提取需要5 × 107個(gè)細(xì)胞。加入1.5 ml冰預(yù)冷的Mito-Cyto Buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到小容量玻璃勻漿器內(nèi)。用間隙嚴(yán)密的研杵研磨細(xì)胞30-40次。

2. 將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管。800 × g 離心5 min 4 ºC。細(xì)胞核、大的膜碎片、未裂解細(xì)胞等在管底。

3. 收集上清液并轉(zhuǎn)移到新的離心管。800 × g 離心5 min at 4 ºC。棄沉淀

4. 將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管。12,000 × g 離心10 min 4 ºC。離心后的上清含胞漿成分，將上清轉(zhuǎn)移到新離心管。線粒體沉淀在管底。

5. 洗滌線粒體：清除管內(nèi)壁粘連的液體和碎片，加入0.2 ml Mito-Cyto Buffer重懸線粒體沉淀，12,000 × g 離心10 min 4 ºC。棄上清。

6. 用Mito-Cyto Buffer或合適的反應(yīng)緩沖液重懸線粒體沉淀，50 µl/每100 mg組織，100 µl/5 × 10⁷個(gè)細(xì)胞。測(cè)定蛋白濃度。立即使用或−70 ºC保存。

 

線粒體和胞漿蛋白制備試劑盒