ATP 酶測(cè)定試劑盒（測(cè)普通組織勻漿）

(貨號(hào)：A016-2 不高速可測(cè) Na +k +、Ca 2+Mg 2+、Ca 2+、Mg 2+-ATPase)

此試劑盒可測(cè)不需要高速離心的紅細(xì)胞膜以及不需要高速離心的組織勻漿中的 ATP 酶。

一、試劑組成與配制(50 管/48 樣 A016-2-1)：

試劑一：液體 10mL×3 瓶，4℃保存 6 個(gè)月。

試劑二：液體 10mL×1 瓶，4℃保存 6 個(gè)月。

試劑三：液體 10mL×1 瓶，4℃保存 6 個(gè)月。

試劑四：粉劑×3 支，-20℃以下保存 6 個(gè)月。用時(shí)每支

加雙蒸水 5mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。余下的-20℃以下可

保存一周。

試劑五：粉劑×1 支，

4℃保存 6 個(gè)月。用時(shí)加雙蒸水 5mL，

適當(dāng)加熱溶解，4℃保存 3 個(gè)月。

試劑六：粉劑×1 支，4℃保存 6 個(gè)月。用時(shí)加雙蒸水

10mL[注 1]，充分加熱使其溶解，室溫保

存。

試劑七：液體 10mL×2 瓶，室溫保存 6 個(gè)月。

試劑八：粉劑×3 瓶，

4℃保存 6 個(gè)月。用時(shí)每瓶加水 40mL

溶解。(溶解后避光 4℃可保存一周)。

試劑九：粉劑×1 瓶，4℃保存 6 個(gè)月。用時(shí)加水 100mL

溶解，室溫保存 3 個(gè)月。

試劑十：2.5mol/L 硫酸 100mL×1 瓶，室溫保存 6 個(gè)月。

試劑十一：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保

存 6 個(gè)月。0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：用

時(shí)將貯備液 20 倍稀釋?zhuān)慈?/span> 0.5mL 加蒸餾水

定容至 10mL。

定磷劑的配制：按雙蒸水: 2.5mol/L 硫酸:試劑八:試劑九

=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃

色，若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，

定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

[注 1]：試劑六為過(guò)飽和溶液，所以在配制時(shí)用

90℃～100℃的熱蒸餾水 10.3mL(熱脹冷縮)邊

隔水加熱邊用玻璃棒攪拌，以使其充分溶解。

一次實(shí)驗(yàn)用不完再用時(shí)可能有結(jié)晶，用之前可

以再次邊隔水加熱邊玻璃棒攪拌使其溶解。

[注 2]： 配試劑用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，

也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

四、如果您的樣本很多可以采用簡(jiǎn)便操作法：

測(cè)試前 A、B、C、D、E 五種混合試劑的配制：

根據(jù)規(guī)范操作表中 A、B、C、D、E 各管的試劑量

乘以您所需要測(cè)試的樣本數(shù)(n)再放寬 1～2 只的量(避

免吸到最后試劑量不夠)，然后縱向混合。 

六、測(cè)定意義：

ATP 酶存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上，是生物膜

上的一種蛋白酶，它在物質(zhì)運(yùn)送、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳

遞方面具有重要的作用。

七、測(cè)定原理：

ATP 酶可分解 ATP 生成 ADP 及無(wú)機(jī)磷，測(cè)定無(wú)機(jī)磷的

量可判斷 ATP 酶活力的高低。

八、注意點(diǎn)：

1、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試

管要求嚴(yán)格，要沒(méi)有一點(diǎn)磷，若試管放過(guò)磷酸或磷酸鹽

緩沖液，一定要洗得非常干凈，要先用洗潔精加水煮，

再用自來(lái)水沖，最后用蒸餾水沖干凈。用一次性塑

料管或新玻璃管，避免磷污染是檢測(cè)成敗的關(guān)鍵。

2、定磷劑配好后，不可放置太久，一般保存一天，現(xiàn)

用現(xiàn)配。隨時(shí)放冰箱。

3、采用先配 A、B、C、D、E 五種混合液中的幾種，

然后按簡(jiǎn)化操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。這樣快捷、準(zhǔn)確。

4、所有配試劑的器皿均要專(zhuān)用，包括吸硫酸的吸管及盛水

的器皿，用新的。

5、本研究所有加厚的一次性塑料試管供應(yīng)，請(qǐng)?jiān)谟嗁?gòu)試劑

的同時(shí)訂購(gòu)一次性塑料試管。

附錄Ⅰ：樣本前處理

一、樣本前處理：

1、全血的前處理：

①、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(詳見(jiàn)附錄Ⅱ)或血紅蛋白測(cè)定。兩者

只需測(cè)其中一樣。

②、洗滌紅細(xì)胞：取肝素抗凝全血 1mL，(若血樣較

少，則可以按一定比例減少血樣及各試劑的用

量。)加 4 倍左右的生理鹽水(0.86%NaCL 液)，

輕輕混勻，

1000～1500 轉(zhuǎn)/分，離心 5～10 分鐘，

棄上清留沉淀的紅細(xì)胞。

③、制備溶血液：在上述沉淀的紅細(xì)胞中加入 1.5mL

雙蒸水，將試管放在旋渦混勻器上混勻 30 秒，

放置 15 分鐘。再混勻 30 秒，再放置 15 分鐘，

使其充分溶血，直至溶液透亮。糖尿病大鼠的

紅細(xì)胞是不可以冰凍，否則越凍越不溶血。

④、取溶血液按操作表進(jìn)行 ATP 酶檢測(cè)和血紅蛋白

測(cè)定。

2、組織的前處理：準(zhǔn)確稱(chēng)取組織重量按重量(g):體積

(mL)=1:9 的比例加入 9 倍體積的生理鹽水，冰

水浴條件下，機(jī)械勻漿，制備成 10%的勻漿液，

2500 轉(zhuǎn)/分離心 10 分鐘，取上清 0.2mL加 0.8mL

生理鹽水稀釋成 2%的勻漿待測(cè)。(取得的上清

液同時(shí)測(cè)一下相應(yīng)樣本的蛋白濃度，總蛋白測(cè)

定試劑盒，本所有售，推薦 A045-2，考馬斯亮

蘭法)

3、培養(yǎng)細(xì)胞的前處理：將培養(yǎng)細(xì)胞消化，離心，棄上

清，留下層細(xì)胞，用生理鹽水或勻漿介質(zhì)制備

成 10 7 /cm3的懸液，即 10 7 /mL 的懸液，再進(jìn)行

破碎。破碎細(xì)胞的方法有三種：①、用勻漿器

勻漿。(可以用勻漿機(jī)，也可以用玻璃勻漿器手

工勻漿。)②、用進(jìn)口的超聲粉碎器粉碎。③、

反復(fù)凍溶 3 次。(第③種方法有時(shí)會(huì)影響酶活

力。)制備好的勻漿液不需要離心，在測(cè)試加樣

前要搖勻后取樣。(破碎好的勻漿液同時(shí)測(cè)一下

相應(yīng)樣本的蛋白濃度，總蛋白測(cè)定試劑盒，本

所有售，推薦 A045-4，BCA 法)

二、參考取樣量：

溶血液一般取 200μL，2%組織勻漿一般取 200μL，

細(xì)胞懸液一般取 200～300μL。如果您的樣本量很少，請(qǐng)

用超微量 ATP 酶檢測(cè)方法。

附錄Ⅱ：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法

紅細(xì)胞計(jì)數(shù)有以下三種方法，只需取其中一種即可以。

(我所有制備好的曲線供您參考。)

1、計(jì)數(shù)板直接紅細(xì)胞計(jì)數(shù)：

①、紅細(xì)胞稀釋液的配制：檸檬酸三鈉 3.8 克，甲醛 1mL，

蒸餾水 100mL，混勻，4℃保存。

②、取 1 支試管，加入紅細(xì)胞稀釋液 2mL，取抗凝全血

10µL 加入試管稀釋液中，反復(fù)吹吸數(shù)次，再將試管

顛倒數(shù)次混勻。

③、取一滴稀釋血液灌入計(jì)數(shù)板。(應(yīng)一次灌滿(mǎn)，而且不

要灌得太多。)

④、用高倍鏡計(jì)數(shù)左上、左下、右上、右下，中央 5 個(gè)中

方格的紅細(xì)胞數(shù)，將數(shù)得的數(shù)字×10 10，即為每升血

中的紅細(xì)胞數(shù)。

2、光電比濁法計(jì)紅細(xì)胞數(shù)：

取試管 1 支，加入上述紅細(xì)胞稀釋液 4mL，再取 20µL

抗凝全血，加入 4mL 稀釋液中，反復(fù)吹吸數(shù)次，再將試

管顛倒數(shù)次混勻，立即倒入比色杯中，于 540nm，1cm 光

徑，蒸餾水調(diào)零進(jìn)行比色，記下吸光度值。以計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)

的紅細(xì)胞的數(shù)值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)管的吸光度值為縱坐

標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。您可以不做曲線，用附錄Ⅲ的參考標(biāo)

準(zhǔn)曲線圖二(鼠紅細(xì)胞數(shù)與比濁法吸光度換算曲線)。根據(jù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線查出紅細(xì)胞數(shù)。

3、用血紅蛋白(Hb)來(lái)?yè)Q算紅細(xì)胞數(shù)：

取 10µL 抗凝全血加入 2.5mL 血紅蛋白測(cè)試液中，混

勻，靜置 10 分鐘，于 540nm，1cm 光徑，蒸餾水調(diào)零進(jìn)

行比色。將測(cè)得的吸光度乘以 367.7 即為血紅蛋白的值。

以計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的紅細(xì)胞的數(shù)值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)管的血紅

蛋白數(shù)為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。您可以不做曲線，用附錄

Ⅲ的參考標(biāo)準(zhǔn)曲線圖一(鼠紅細(xì)胞數(shù)與血紅蛋白數(shù)的換算

曲線)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出紅細(xì)胞數(shù)。

ATP 酶測(cè)定試劑盒（測(cè)普通組織勻漿）