免疫熒光雙標(biāo)三色掃描全套（切片）

服務(wù)介紹：

抗原抗體的結(jié)合非常特異。免疫熒光雙標(biāo)是用兩種不同種屬來(lái)源的抗體共同孵育同一張組織切片，兩種抗體分別與兩種目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合，然后再用帶有不同顏色的熒光染料標(biāo)記的第二抗體分別與其對(duì)應(yīng)的第一抗體結(jié)合，在組織切片掃描儀或者熒光顯微鏡下用對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的光去激發(fā)染料發(fā)出兩種不同的熒光，進(jìn)而將兩種不同目標(biāo)蛋白通過(guò)間接標(biāo)記的方式用兩種熒光顯示出來(lái)。也可以利用TSA技術(shù)進(jìn)行熒光標(biāo)記，有信號(hào)放大的作用同時(shí)可以不限制一抗的種屬，同源或異源一抗都可以標(biāo)記。TSA技術(shù)主要原理為用HRP標(biāo)記的第二抗體與第一抗體結(jié)合后，再孵育熒光標(biāo)記的酪胺（TSA），TSA在二抗上偶聯(lián)的HRP與H₂O₂的作用下變?yōu)榛罨睦野凡⒏街谀繕?biāo)蛋白周圍的蛋白酪-氨酸殘基上，此結(jié)合是共價(jià)結(jié)合。而一抗與靶標(biāo)、二抗與一抗之間是非共價(jià)結(jié)合。通過(guò)高溫和微波處理，非共價(jià)結(jié)合的一抗二抗被打斷并洗脫掉，而共價(jià)結(jié)合的熒光酪胺依然附著在靶標(biāo)周圍，進(jìn)而將靶標(biāo)通過(guò)熒光標(biāo)記顯示出來(lái)。每輪標(biāo)記都按一抗-二抗-TSA的順序?qū)ο鄳?yīng)抗原進(jìn)行標(biāo)記，每輪染色只需改變TSA熒光染料種類即可實(shí)現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)用不同熒光染料進(jìn)行共同標(biāo)記。在組織切片掃描儀或者熒光顯微鏡下用熒光染料對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的光去激發(fā)染料發(fā)出熒光進(jìn)而將目標(biāo)蛋白通過(guò)間接標(biāo)記的方式顯示出來(lái)。

 切片數(shù)字掃描是通過(guò)控制顯微成像系統(tǒng)和切片以一定的規(guī)則運(yùn)動(dòng)，采集多張連續(xù)的高分辨率顯微圖像再無(wú)縫拼接生成一張高分辨率的組織切片全景圖像。該圖像包含了玻片上所有的信息，可在電腦上用瀏覽軟件任意放大和縮小，任意部位觀察采圖，是真正脫離顯微鏡的閱片方式。通過(guò)在掃描儀上加載與免疫標(biāo)記時(shí)熒光染料匹配的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的濾光塊，獲取不同熒光通道的圖像?？蓡瓮ǖ溃嗤ǖ廊我饨M合瀏覽并按需采圖。

送樣運(yùn)輸要求：

1、組織樣本放置于10倍樣本體積的通用型組織固定液中固定24h以上，常溫保存運(yùn)輸石蠟包埋切片或者冰凍切片。置于固定液內(nèi)的組織切勿冷凍結(jié)冰，切勿固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。細(xì)胞爬片用通用型組織固定液固定，封口膜封好防止漏液，常溫保存運(yùn)輸。

2、石蠟切片常溫保存運(yùn)輸。冰凍切片-20°保存運(yùn)輸。

實(shí)驗(yàn)大體流程：

熒光二抗法：

石蠟切片脫蠟至水（冰凍切片和細(xì)胞爬片無(wú)需此步）——微波抗原修復(fù)——畫(huà)圈血清封閉——同時(shí)孵育兩種異源一抗——同時(shí)孵育對(duì)應(yīng)種屬的兩種熒光二抗——DAPI染核——自發(fā)熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像。

TSA法

石蠟切片脫蠟至水（冰凍切片和細(xì)胞爬片無(wú)需此步）——微波抗原修復(fù)——畫(huà)圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF555-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第二種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA ——DAPI染核——自發(fā)熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像。 

熒光二抗法實(shí)驗(yàn)具體流程：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液II 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-無(wú)水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗。

2、抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)緩沖液（PH 6.0 檸檬酸；PH 9.0 EDTA； PH 8.0 EDTA）的抗原修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。維持緩沖液沸騰10min左右，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min(修復(fù)液種類和修復(fù)條件根據(jù)組織來(lái)確定，優(yōu)先推薦 PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液）。

3、畫(huà)圈血清封閉：切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫(huà)圈（防止試劑流走），切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來(lái)源用10%兔血清封閉，一抗其它來(lái)源的用3%BSA封閉。

4、加兩種異源一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無(wú)菌PBS按一定比例配好的兩種一抗，切片平放于透明濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）。

5、加對(duì)應(yīng)種屬熒光素標(biāo)記的二抗（常用iF488和CY3標(biāo)記的二抗）：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內(nèi)滴加與兩種一抗分別對(duì)應(yīng)種屬的熒光素標(biāo)記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

6、DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

7、自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

8、封片：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

9、鏡檢成像：切片置于玻片數(shù)字掃描儀下掃描全景成像。各種熒光素顏色及激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)見(jiàn)下表。

TSA法實(shí)驗(yàn)具體流程：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環(huán)保型脫蠟液I 10min-環(huán)保型脫蠟液II 10min-環(huán)保型脫蠟液III 10min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-無(wú)水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗。

2、抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿抗原修復(fù)緩沖液（ PH 6.0 檸檬酸； PH 9.0 EDTA；PH 8.0 EDTA）的抗原修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。維持緩沖液沸騰10min左右，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min(修復(fù)液種類和修復(fù)條件根據(jù)組織來(lái)確定）。

3、畫(huà)圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫(huà)圈（防止試劑流走），切片平放于避光濕盒滴加3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min左右，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

4、血清封閉：切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來(lái)源用10%兔血清封閉，一抗其它來(lái)源的用3%BSA封閉。

5、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無(wú)菌PBS按一定比例配好的第一種一抗，切片平放于透明濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）。

6、加對(duì)應(yīng)種屬HRP標(biāo)記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7、加iF555-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF555-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

8、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經(jīng)結(jié)合到組織上的一抗二抗，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。

9、血清封閉：切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來(lái)源用10%兔血清封閉，一抗其它來(lái)源的用3%BSA封閉。

10、加第二種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無(wú)菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過(guò)夜（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）。

11、對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

12、加iF488-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加iF488-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

13、DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

14、自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

15、封片：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

16、鏡檢成像：切片置于玻片數(shù)字掃描儀下掃描全景成像。